不同质量酱香型白酒的挥发性物质差异分析

张晓婕，邱树毅，王晓丹，曾庆军，何 欢，周鸿翔

（贵州大学酿酒与食品工程学院 贵阳 550025）

中国白酒以粮谷为原料，大曲为糖化发酵剂，由白酒酿造用微生物固态发酵，经蒸馏、贮存、勾调而成，是一种著名的蒸馏酒，已有2000 多年的历史[1-2]。酱香型白酒是中国传统白酒基本风味之一，独特的自然环境和工艺条件铸就了“酱香突出，优雅细腻，酒体醇厚，空杯留香，回味悠长”的风味特征，在中国白酒中位据重要地位。酱香白酒的风味复杂，风味物质是内源性的，受原料、酒曲、生产过程、环境等因素的影响[3-4]。不同企业、不同工艺、不同年份等的酱香型白酒之间的风味及香气差异较大，导致市场上酱香型白酒的品质参差不齐。白酒鉴别主要是采用感官品评，通过专业人员对白酒的形、色、香、味进行综合评价[5]。感官品评结果可作为确定白酒质量等级、鉴别假冒伪劣白酒的重要依据，还可以通过品评了解酒质存在的缺点，并对其加以改进，以提高白酒的品质。感官品评存在很大的局限性，其评价结果基于品评人员主观的判断，受个体因素影响较大，同时也难以量化品评结果，只能获得一些描述性的结论[6-7]。到目前为止，感官品评仍是白酒香型、质量等鉴别的重要手段，还没有被任何仪器分析方法所替代。利用仪器检测能辅助解决一些人工品评中产生的问题。结合感官品评和仪器分析对白酒进行鉴别，有利于提高鉴别准确率和标准化。目前，研究人员主要是利用气相色谱法对白酒风味物质进行分析，能检测出酒中大量挥发性物质，通过定性、定量结果及香气活性值（Odor active values，OAV）可以确定白酒骨架成分及重要风味物质[8-9]，由于仪器分析结果数据量大，且有很多与鉴别不相关的信息，因此不能直接用于白酒鉴别，需利用化学计量学方法对其中有用信息进行提取。

聚类分析、主成分分析（Principal component analysis，PCA） 和偏最小二乘-判别分析（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）被应用于白酒不同轮次研究[10]、香型判别[11]、年份识别[12]、产地鉴定[13]等方面。钱冲等[14]使用GC-MS 直接进样，对浓香、清香、酱香、芝麻香和特香型白酒进行检测，并进行聚类分析和主成分分析，依据香型分为5 类，说明聚类分析和主成分分析能区分不同香型的白酒。唐平等[15]对赤水河流域5 个地区的酱香型白酒的挥发性物质进行分析，利用PLS-DA 模型将酒样明显区分为3 类，并用变量重要性因子及层次聚类分析筛选出20 种对地区区分有重要贡献的物质，为不同地区酱香白酒的鉴别提供了理论支撑。

白酒质量与生产工艺、贮存年份等均相关，然而，针对不同质量酱香型白酒目前主要的鉴别方法仍是以感官评价为主。本文采用气相色谱法对同一产区不同质量的酱香型白酒中挥发性物质进行定性、定量分析，通过OAV 分析确定香气贡献物质，用聚类热图直观表达酒样中挥发性物质的差异并对酒样进行聚类。采用主成分分析构建鉴别模型，偏最小二乘-判别分析找出不同质量酒样之间的关键差异物质，为不同质量酱香型白酒鉴别提供量化依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒样：酒样由贵州仁怀某企业提供，均为市场采购的不同质量基酒勾兑的成品酒，总计100 个样品，均为53%vol 酱香型白酒。将酒样按质量分为5 类，其中，特级酒样12 个，一级酒样8 个，二级酒样11 个，三级酒样17 个，四级酒样52 个。鉴别模型验证酒样由3 个企业提供，每组酒样均包含高端、中端、低端3 个级别。所有酒样均在室温下密封且避光贮存。

试剂：无水乙醇（色谱纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；标准品：乙酸乙酯、丙酸乙酯、异丁酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、棕榈酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、正丁醇、辛醇、1，2-丙二醇、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、己酸、乙缩醛、乙偶姻、2，3，5，6-四甲基吡嗪、糠醇、糠醛、苯乙酸乙酯、苯乙醇，乙酸戊酯（IS1）、叔戊醇（IS2）、2-乙基丁酸（IS3），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醛，美国Sigma-Aldrich 公司；2-甲基丁酸乙酯，上海贤鼎生物科技有限公司九鼎化学；异戊醇，上海易恩化学技术有限公司罗恩试剂，以上标准品均为色谱纯且纯度≥97.0%。

1.2 仪器与设备

7890A 气相色谱仪、7890A-5975C 气相色谱-质谱联用仪，安捷伦科技有限公司；PAL 多功能自动进样器，瑞士斯特分析仪器有限公司；CP214 电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白酒挥发性物质的检测

1.3.1.1 酒样预处理 取适量酒样过0.22 μm 有机滤膜，吸取990 μL 过膜后的酒样于2 mL 气相进样瓶中，加入10 μL 混合内标溶液（叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸，体积分数1%），加盖密封，备用、待测。所有酒样重复3 次。

1.3.1.2 GC-MS 测定 GC 条件：SH-Rtx-Wax 色谱柱 （30 m×0.25 mm×0.25 μm，SHIMADZU 221-75893-30）；载气为高纯氦气（99.999%），流速1.00 mL/min；进样口温度250 ℃；分流进样，分流比30 ∶1；溶剂延迟2 min；升温程序：初始温度30℃，保持2 min，以3 ℃/min 升温至180 ℃，再以15℃/min 升温至210 ℃，保持8 min。

MS 条件：电子轰击离子源；离子源温度230℃；四极杆温度150 ℃；电离能量70 eV；全扫描（Scan）模式。

1.3.1.3 GC 测定 SH-Rtx-Wax 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，SHIMADZU 221-75893-30）；载气为高纯氮气（99.999%）；进样口温度250 ℃；分流进样，分流比30∶1；检测器温度250 ℃；氢气流量30 mL/min，空气流量300 mL/min，尾吹气流量30 mL/min；升温程序：初始温度30 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升温至180 ℃，再以15 ℃/min 升温至210 ℃，保持8 min。

1.3.2 挥发性物质的定性及定量 定性方法：结合NIST11 谱库检索及标准品，对照两种方法对酒样中各挥发性物质进行定性。

定量方法：以待测物与内标物的含量比为横坐标，峰面积比为纵坐标，建立各挥发性物质的标准曲线，采用内标法定量酒样中各物质含量。所有酒样重复3 次。

1.3.3 OAV 计算 根据定量结果结合阈值（Odor threshold，OT）计算各挥发性物质OAV 值，计算公式：

式中，c——各挥发性物质质量浓度（mg/L）；OT——各挥发性物质阈值（μg/L），参考文献[3]和[16]获得。

将OAV 值分为OAV＜1，1≤OAV＜10，10≤OAV＜100，OAV≥100 4 个范围。OAV≥1，该物质对白酒香气形成有贡献，且OAV 值越大贡献越大。1≤OAV＜10 的物质对白酒香气有一定贡献，10≤OAV＜100 的物质有较大贡献，OAV≥100 的物质有明显贡献。

1.3.4 鉴别模型验证 选取3 组不同级别的酒样，在1.3.1.1 节条件下对酒样进行预处理，在1.3.1.3 节GC 条件下直接进样对各酒样中挥发性物质进行定量。利用标准化后的定量结果进行主成分综合得分的计算和排名，以对所构建的鉴别模型进行验证。所有酒样重复3 次。

1.4 数据处理

用Origin 2018 软件对数据进行归一化处理；用Heatmap Illustrator 软件绘制聚类热图；用SIMCA 13.0 软件进行主成分分析、偏最小二乘-判别分析及变量权重重要性排序分析；用SPSS 26.0 软件进行主成分分析及单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同质量酒样的挥发性物质

通过对比GC-MS 直接进样分析所得总离子流图与NIST11 质谱库中的化合物，以及GC 分析所得色谱图与标准品的色谱图保留时间，对酒样中各挥发性物质进行定性。在所有酒样中共检出29 种挥发性物质，包括9 种酯类，6 种醇类，6 种酸类，3 种醛酮类，1 种吡嗪类，2 种呋喃类及2 种芳香族化合物。不是所有挥发性物质都对白酒香气产生有贡献，OAV 是建立在准确定量结果的基础上，用于表征挥发性物质在食品中香气贡献大小的量[17]。一般认为OAV≥1 的物质对白酒香气有贡献。由表1可知，乙酸乙酯、丙酸乙酯、异丁酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、正丙醇、正丁醇、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、己酸、乙醛、乙缩醛、乙偶姻、糠醛、苯乙酸乙酯21 个物质对酱香白酒香气形成有贡献，其中丁酸乙酯、戊酸乙酯、乙醛、乙缩醛、乙偶姻的OAV≥100，是酱香型白酒的重要香气化合物。

酯类是白酒发酵过程中各种酶的催化作用下酸类与醇类酯化形成的一类物质，种类及含量丰富，具有芳香气味，是白酒中的重要香气化合物，在各种香型中占35%到70%[10，18]。由表1可看出，酯类OAV 均大于1，不同质量酒样中OAV 变化不大，说明酯类是酱香型白酒香气的主要来源，而不是造成质量差异的主要物质。其中，丁酸乙酯和戊酸乙酯的含量不高，其OAV 值均大于100，且随着质量的提升，其OAV 值呈上升趋势，说明其对酱香白酒香气的形成有明显贡献。Niu 等[19]从茅台酒中提取分析31 种酯类，发现乙酸乙酯和乳酸乙酯是含量最高的两种酯类，然而其OAV 值较低，己酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯等在茅台酒中具有较高的香气强度，与本研究结果相似。

醇类和酸类是酯类的前驱物质，醇类是白酒醇甜和助香剂的主要来源[20]。由定量结果可知，这两类物质的阈值较高，OAV 整体不高，且OAV≥10 的只有异丁酸和丁酸。白酒中绝大部分酸类是挥发性有机酸，以乙酸为主，酸类OAV 均大于1，说明酸类在酱香白酒香气形成中发挥重要作用，其对白酒风味的贡献侧重于口感[21]。同时，酸类物质也是白酒后味的重要组分，对后味贡献较大[22]。不同质量酒样中醇类和酸类物质的OAV 值变化不明显，只有正丙醇、正丁醇、丙酸、异戊酸存在一定差异，可能是差异贡献物质。

醛酮类物质主要由发酵过程中微生物代谢及陈酿过程中醇类氧化、酮酸脱羧等产生[23]。由于含量较高且阈值较低，因此对酱香型白酒整体香气形成具有明显贡献，且其OAV 值在不同质量酒样中变化较大，基本上随质量等级的升高，其OAV值呈上升趋势，尤其是乙醛和乙缩醛。乙缩醛是由乙醛与乙醇缩合而成，其OAV 值＞1 000，赋予白酒清香柔和感[20]。

吡嗪类赋予白酒坚果味和焙烤香气，在白酒中含量极低，而对其它香气物质有明显的烘托叠加作用[23-24]。呋喃类由高温下碳水化合物分解及美拉德反应产生[25]，酱香型白酒中含量明显高于其它香型，尤其是糠醛，在一定条件下会生成糠醇；芳香族化合物主要由微生物发酵原料或制曲过程中的中间产物在发酵过程中相互转化而成[26]，赋予白酒花香及果香。由表1可知，这3 类物质含量及OAV 均较低，且基本上不随质量的改变而变化，说明其对整体香气形成及差异形成均无明显贡献，然而有利于促进其它物质对香气的贡献程度。

表1 不同质量酒样挥发性物质的定性、定量分析及OAVsTable 1 Qualitative and quantitative analysis and OAVs of volatile components in samples of different quality

（续表1）

不同质量酒样中挥发性物质的含量及比例也不同。由表2可知，随着酒样质量的提升，醇类、醛酮类、呋喃类物质以及挥发性物质的总量均呈上升趋势，可能是由于质量较差的白酒中一些含量较低的挥发性物质未被检出，如异丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、1，2-丙二醇、异戊酸、糠醇、苯乙酸乙酯等，这些物质有可能是导致低质量酒样与其它酒样风味差异的原因之一。由表3可知，各类挥发性物质与总量之比也随质量的改变而发生变化，其中酯类与酸类化合物含量占挥发性物质总量的比例随质量的提升呈下降趋势，而醇类和醛酮类相反。

表2 不同质量酒样中各类挥发性物质含量及总量（mg/L）Table 2 Content and total amount of volatile components in samples of different quality（mg/L）

表3 不同质量酒样中各类挥发性物质含量与总量之比Table 3 The ratio of content to total amount of volatile components in samples of different quality

不同质量酒样中一些挥发性物质的OAV 存在差异，可作为鉴别不同质量白酒的差异贡献物质，主要包括2-甲基丁酸乙酯、正丙醇、正丁醇、丙酸、异戊酸、乙偶姻、糠醛、苯乙酸乙酯。

2.2 不同质量酒样的鉴别

2.2.1 聚类分析 对酒样中29 种挥发性物质的定量结果进行归一化，绘制聚类热图，以显示不同质量酒样中各挥发性物质含量的差异及聚类过程。由图1可知，随着酒样质量的提高，挥发性物质的总量呈升高趋势，即质量越好挥发性物质总量越高，不同质量酒样被明显区分开。聚类结果表明，三级和四级酒样为一类，一级酒样与特级酒样为一类，二级酒样单独为一类，且更靠近三级及四级酒样，说明二级以下酒样中挥发性物质较相近，与二级以上酒样中挥发性物质差异较大。

图1 不同质量酒样聚类热图Fig.1 Cluster heat maps of samples in different quality

2.2.2 PCA PCA 是一种常用的多元分析方法，是一种降维工具[13]，可将多个变量指标归纳为少数几个综合指标以利于分析，用于初步探索数据内部结构和样品聚类[27]。对29 种挥发性风味成分含量进行PCA，由表4可知，前6 个主成分的累计贡献率为74.699%，可代表大部分成分信息，代替原来的29 个挥发性物质进行分析，得到其主成分的特征值、方差贡献率及累计贡献率（表4），主成分载荷矩阵及特征向量（表5）。

表4 主成分特征值及其贡献率Table 4 Principal component eigenvalues and contribution rates

由表5可建立6 个主成分的线性回归方程，即：

表5 主成分载荷矩阵及特征向量Table 5 Principal component load matrix and eigenvector

PC1=0.101X1+0.159X2+0.109X3+0.198X4+……+0.265X27-0.003X28+0.241X29

PC2=-0.029X1+0.236X2+0.109X3+0.064X4+……-0.044X27-0.003X28+0.071X29

PC3=-0.147X1-0.188X2+0.223X3-0.300X4+……+0.031X27-0.099X28+0.277X29

PC4=-0.515X1-0.182X2+0.180X3+0.211X4+……+0.054X27+0.013X28+0.033X29

PC5=0.084X1-0.009X2+0.178X3-0.180X4+……+0.345X27+0.123X28+0.042X29

PC6=-0.117X1+0.038X2-0.159X3+0.028X4+……-0.030X27-0.083X28-0.245X29

以每个主成分所对应的特征值占所提取主成分总的特征值之和的比例作为权重，计算主成分综合得分模型[28]：×PC6

式中，α1、α2、α3、α4、α5、α6分别代表第1 主成分、第2 主成分、第3 主成分、第4 主成分、第5 主成分、第6 主成分的特征值。

根据上述主成分特征值可知：

F =0.3559PC1 +0.2256PC2 +0.1972PC3 +0.0918PC4+0.0719PC5+0.0577PC6

利用PCA 构建鉴别模型，找出鉴别不同质量酱香型白酒的客观评价方法。根据评价模型计算不同质量酒样主成分得分及综合得分。由表6可知，综合得分与酒样质量呈正比，即质量等级越高综合得分越高。说明建立的模型具有实际意义，能够判别不同质量酱香型白酒酒样。

表6 不同质量酒样主成分得分及综合得分Table 6 Principal component score and comprehensive score of samples in different quality

PCA 作为一种多元分析法，还可运用于产品类型的判别[28]。以不同质量酒样PC1 为横坐标，PC5 为纵坐标作散点图（图2）。由图2可知，通过PCA 模型将不同质量酱香型白酒明显区分为3类，该结果与聚类分析的结果相对应。

图2 不同质量酒样主成得分图Fig.2 Main score chart of samples in different quality

2.3 不同质量酒样的关键差异物质

2.3.1 PLS-DA 模型检验结果 PLS-DA 是一种用于预测和描述建模的多元统计分析方法[13]。采用SIMCA 13.0 进行PLS-DA，找出不同质量酒样之间的差异物质。如图3所示，由R2和Q2回归线可知，通过置换检验得到的R2和Q2都小于模型原始值，说明模型稳健[29]。置换检验得到的R2=0.0226，Q2=-0.0607，Q2于Y 轴的截距是负值，说明此模型没有过拟合现象[29]，模型预测能力良好，可用于后续确定差异物质。

图3 PLS-DA 模型的置换检验Fig.3 PLS-DA permutation test

图4反映每个变量对已构建模型的贡献大小。其中，离原点和主要化合物团越远，该挥发性物质对不同质量酒样差异形成的贡献越大。可以看出，丁酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、正丁醇、1，2-丙二醇、丙酸、异戊酸、乙醛、乙缩醛、乙偶姻、糠醛、糠醇、2，3，5，6-四甲基吡嗪、苯乙醇均离原点和主要化合物团较远，对各质量酒样的差异贡献较大。

图4 不同质量酒样PLS-DA 载荷图Fig.4 PLS-DA loading plot of samples in different quality

2.3.2 变量权重重要性排序（Variable importance for the projection，VIP） 分析 用VIP 可以量化PLS-DA 中每个变量对样品分类的贡献，VIP＞1 可认为该变量为该判别模型的关键变量，且VIP 值越大，该物质在判别过程中的贡献越大[30]。由图5可判断每个物质对酒样分类的贡献大小，VIP＞1的挥发性物质为差异贡献物质，即正丁醇（VIP=1.72597）、异戊酸（VIP=1.62707）、糠醛（VIP=1.56644）、乙缩醛（VIP=1.32515）、2-甲基丁酸乙酯（VIP=1.30311）、异丁酸（VIP=1.29027）、乙醛（VIP=1.29007）、苯乙醇（VIP=1.25216）、正丙醇（VIP=1.15065）、1，2-丙二醇（VIP=1.1261）、棕榈酸乙酯（VIP=1.10403）、丁酸乙酯（VIP=1.08735）、糠醇（VIP=1.06983）。

图5 不同质量酒样VIP 图Fig.5 VIP analysis of samples in different quality

2.3.3 关键差异物质 综合OAV 分析、PLS-DA载荷图及VIP 分析结果可知，不同质量酒样差异贡献物质主要包括丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、棕榈酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、正丁醇、1，2-丙二醇、丙酸、异戊酸、异丁酸、乙醛、乙缩醛、乙偶姻、糠醛、糠醇、2，3，5，6-四甲基吡嗪、苯乙酸乙酯、苯乙醇18 个挥发性风味物质。

采用SPSS 26.0 对这18 个差异贡献物质进行单因素方差分析，以P 值小于0.01 表示具有极显著差异的物质。最终确定12 个关键差异物质，即2-甲基丁酸乙酯、棕榈酸乙酯、正丁醇、正丙醇、1，2-丙二醇、异戊酸、异丁酸、乙缩醛、乙醛、糠醛、糠醇、苯乙醇。

2.4 不同级别酱香型白酒鉴别模型验证结果

在相同条件下分别对3 个企业提供的不同级别酱香型白酒进行定量。采用已构建的鉴别模型（2.2.2） 计算各酒样的综合得分F 并对其排名，对鉴别模型进行验证。由表7可知，3 组不同级别酱香型白酒的综合得分F 均为高端酒样最高，中端次之，低端最低。3 组高端酒样的综合得分F 均大于1.00，结合表6可判断其品质应与模型中一级以上酒样类似；3 组中端酒样的综合得分从-0.13 至0.46，与模型中中等质量酒样匹配，而3 组低端酒样的综合得分均低于-1.00，由此可判断其品质与模型中四级酒样接近。本研究构建的鉴别模型可有效识别不同级别酱香型白酒，具有实际应用意义。

表7 不同级别酱香型白酒综合得分Table 7 Comprehensive score of different grades of Maotai-flavor liquor

3 结论

将酒样按不同质量分为5 类，采用直接进样法结合GC-MS 和GC 对100 个酒样进行定性、定量分析，共检出29 种挥发性物质，包括9 种酯类，6 种醇类，6 种酸类，3 种醛酮类，1 种吡嗪类，2 种呋喃类以及2 种芳香族化合物。其中酯类含量最高，约占总量的50%，其OAV 均大于1，是果香、花香和甜味的主要来源[19]，然而，除2-甲基丁酸乙酯外，各级质量酒样中其余酯类物质OAV 变化不大。酸类的含量仅次于酯类，在酱香型白酒香气形成中发挥重要作用。酯类和酸类物质OAV 值变化不明显，只有正丙醇、正丁醇、丙酸、异戊酸在不同质量酒样中的OAV 存在一定差异。乙醛和乙缩醛对酱香白酒整体香气形成贡献明显，且OAV 值随质量的提升呈明显升高趋势。相反，吡嗪类、呋喃类以及芳香族化合物含量较低且阈值偏高，且其OAV 值在不同质量酒样中基本没有变化，对整体香气形成和差异形成均无明显贡献。

采用多元统计分析酒样中挥发性物质，聚类分析和主成分分析均可将不同质量酱香型白酒明显区分为3 类。利用主成分分析构建不同质量酱香型白酒鉴别模型，选择3 组不同级别酒样进行验证，结果表明，鉴别模型均能很好地识别不同级别酱香型白酒。利用PLS-DA 分析及单因素方差分析最终确定5 类不同质量酱香型白酒间的12个关键差异物质，即2-甲基丁酸乙酯、棕榈酸乙酯、正丁醇、正丙醇、1，2-丙二醇、异戊酸、异丁酸、乙缩醛、乙醛、糠醛、糠醇、苯乙醇。正是这些物质造成不同质量酱香型白酒间的差异。

采用气相色谱结合化学计量学方法能够区分不同的质量酒样，并筛选出其中的关键差异物质。此方法比传统的感官鉴定更加客观。虽不能完全替代感官品评方法，但可将鉴别模型与感官分析相结合，用于不同质量酱香型白酒的鉴别，从而提供一种更高效、准确的鉴别方法，提高鉴别结果的可信度。本模型的后续研究可延伸到不同产区的酱香型白酒品质鉴定及验证，以确认其是否具有严格意义的普适性。