糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白在糖皮质激素作用中的角色及分子机制

周 红

（遵义医科大学药学院基础药理教育部重点实验室，贵州 遵义 563006）

1 前言

内源性糖皮质激素（glucocorticoids，GCs）是人体内一种重要的甾体类激素，由肾上腺皮质中的束状带所分泌，受下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamicpituitary-adrenal axis，HPA）的调控，参与物质代谢，协调对外源性刺激的生理反应，维持机体内环境稳态［1］。GCs 由于其强大的抗炎与免疫抑制作用被广泛用于自身免疫性疾病和炎症相关性疾病的治疗。然而任何药物都是一把双刃剑，在发挥其治疗作用的同时，不可避免地会存在一定的不良反应，GCs也不例外。长期或者大剂量使用会产生严重的不良反应，如免疫抑制、高血压、高血糖、骨质疏松、情绪障碍、库欣综合征、糖皮质激素抵抗等［2］，尤其是免疫抑制严重限制了GCs 的应用。近些年来发现的糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白（glucocorticoidinduced leucine zipper protein，GILZ））能被GCs 稳定而快速地诱导表达［3］，广泛分布在多种组织和细胞中，可以介导GCs 的抗炎与免疫抑制作用［4］，而且GILZ 在发挥作用的同时没有GCs的严重不良反应，因此研究GILZ 在GCs 中的作用及其分子机制对寻找替代GCs的药物及药物靶点具有重要意义。

2 GILZ的结构

1997 年D'Adamio 等在研究GCs 对淋巴细胞的调节并发现GILZ［3］。人GILZ 属于TSC22D 蛋白质家族的成员，由TSC22D3 基因编码，是被GCs 调控的早期靶基因，在免疫细胞和非免疫细胞中均可被GCs 上调［5］。目前，研究发现GILZ 是GCs 的重要下游执行分子，但是又不完全等同于糖皮质激素的效应，因此其作用和角色越来越受到研究者的重视。

人GILZ 蛋白质由137 个氨基酸残基组成，有3 个典型的结构域：N 端结构域（位于第1～75 氨基酸）、亮氨酸拉链结构域（leucine zipper domain，LZ，位于第76～97 氨基酸）、C 端富含脯氨酸及谷氨酸残基（位于第98～137 氨基酸），不含明显的DNA 结合序列。GILZ 发挥作用需要其同源二聚化，而LZ 结构域在介导GILZ 的同源二聚化中发挥重要作用。GILZ 的N 端和C 端结构域是GILZ 与其他蛋白质发生相互作用的结构域，尤其是与转录和信号分子的相互作用，而这些相互作用对GILZ乃至GCs的抗炎和免疫抑制作用至关重要［6］。也有研究发现，GILZ与其他蛋白分子尤其是和转录因子的相互作用与LZ 结构域、C-末端结构域（特别是121～123 位氨基酸）均密切相关［7］；而N 端结构域是GILZ-Raf 相互作用调节MAPK通路所必需的［8］。

3 GILZ 在GCs 介导的细胞转导信号通路中的作用

GCs产生的药理学效应包括治疗作用和不良反应，多数均为通过糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）介导的效应。GR 是NR3C1 基因编码的转录因子，属于核受体超家族成员［9］。由于GCs是亲脂性激素，很容易跨过细胞膜，从而与胞质内GR 结合；当GCs 与GR 结合形成激素-受体复合物后GR 发生构象变化并进入细胞核，然后与糖皮质激素反应元件（glucocorticoid response elements，GREs）结合，激活或抑制靶基因的表达从而发挥作用。

GCs对基因表达的调控作用可以分为反式激活和反式抑制作用两种［10］。在反式激活作用中，除了抗炎作用蛋白的表达增加外，参与葡萄糖和脂质代谢的酶也被激活，导致高血糖和肌肉萎缩等代谢相关作用的出现。因此，有研究者提出通过调节GR活性将GCs 的治疗作用与副作用分离，从而设计有利于发挥反式抑制作用的选择性GR 激动剂（selective glucocorticoid receptor agonists，SEGRA）或调节剂（selective glucocorticoid receptor modulators，SEGRM）［11］，然而上述设想并未实现。为此，研究者们又将目光聚焦到GCs 诱导的具有抗炎活性的蛋白质GILZ，由于GILZ 位于GR 的下游，因此推测不会产生糖皮质激素抵抗的现象［12］。

4 GILZ的作用机制

随着人们对GILZ 的抗炎和免疫抑制作用的认识，GILZ与转录因子的相互作用以及细胞水平上介导的GCs的免疫抑制作用成为人们的研究焦点。

4.1 GILZ与NF-κB

NF-κB 是非常重要的核转录因子，在机体中发挥重要而广泛的调控作用，尤其是在免疫系统中。NF-κB 调控的基因几乎涵盖机体所有的免疫反应，如与调控趋化因子、细胞因子、黏附分子、细胞凋亡等密切相关［13］。NF-κB 以二聚体形式发挥作用，最常见的二聚体是NF-κB p65 与NF-κB p50 组成的异源二聚体，其中NF-κB p65是最重要的亚单位。

最初，Ayroldi 等［7］发现GILZ 可直接与NF-κB结合并抑制其激活。GILZ 的高表达可抑制NF-κB p65 的核转位，但并不影响NF-κB 的抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）的磷酸化和降解，也不影响IκB 与NF-κB 的结合。Berrebi 等［14］在巨噬细胞中发现，GILZ 与NF-κB p65 亚单位结合，抑制如共刺激分子CD80 和CD86 的表达。在树突状细胞中，过度表达的GILZ 会通过干扰NF-κB 参与的信号转导途径介导的T 细胞活化、T 细胞耐受效应［15］。在B细胞中，缺乏GILZ 会引起NF-κB 转录活性增加，导致非致死性B 淋巴细胞增多症的发生［16］。在骨髓间充质干细胞中，GILZ 通过抑制NF-κB 发挥抑制环氧酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）表达的作用，敲除GILZ 基因则能降低GCs 对COX-2 表达的抑制作用［17］。在人脂肪细胞中，GILZ 通过抑制NF-κB p65核转位，抑制TNF-α 的表达［18］。上述研究表明，NF-κB 与GILZ 发挥抗炎和免疫抑制作用密切相关。

4.2 GILZ与转录激活因子1

核转录激活因子1（activator protein 1，AP-1）是炎症反应中免疫细胞激活的关键核转录因子之一，GILZ 可以通过其N 末端结构域结合AP-1，从而抑制AP-1 的活化，该作用有助于GCs 通过GR 非依赖方式调节AP-1 的活化。有研究发现，在GILZ 缺陷小鼠中，B 细胞中IFN-γ 表达增加，该作用与GILZ减少后GILZ 结合AP-1 减少，导致AP-1 核转位增加有关。因此，AP-1介导的IFN-γ 表达增加与B 细胞功能增强以及炎症性疾病的发生、发展密切相关［19］。

4.3 GILZ与MAPK

MAPK 信号转导途径调节机体众多的生理、病理过程如细胞生长、分化、应激和炎症反应［20］，AP-1复合物的活性受到c-Jun 和c-Fos 的调控。GILZ 可以通过与MAPK 家族成员的Raf-1 蛋白激酶发生相互作用，导致Raf-1 蛋白激酶的磷酸化作用受到抑制，从而抑制MEK／ERK 的磷酸化和AP-1 依赖的蛋白质转录过程［8］。

5 GILZ对免疫系统的影响

5.1 GILZ对先天性免疫系统的影响

先天性免疫系统是机体抵抗细菌、病毒等外源性有害微生物侵入的第一道防线，包括单核/巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞等。

在巨噬细胞中，GILZ 是膜联蛋白A1（annexin A1，ANXA1）发挥抗炎作用的关键分子。ANXA1 通过GILZ 抑 制TNF-α 和IL-6 的 表 达，进 而 抑 制MAPK 通路的激活，达到抑制巨噬细胞对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）反应的目的［21］。在人肺泡巨噬细胞中，GILZ 能下调Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）的表达，减少前炎症细胞因子的释放，从而抑制巨噬细胞的吞噬和杀伤作用［22］。在脓毒性休克小鼠模型中，单核/巨噬细胞中的GILZ 可以抑制全身炎症反应的发生［23］。因此，GILZ目前已经成为治疗脓毒症的潜在靶点。

在树突状细胞（dendritic cell，DC）中，GILZ 可抑制组织相容复合体Ⅱ（histocompatibility complex，MHC Ⅱ）类分子、共刺激因子的产生以及调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）的生成［24］。在敲除GILZ（GILZ-KO）的骨髓源性DC 中，TLR4 和TLR7介导的细胞因子如IL-1α、IL-1β、IL-6 和IL-23 的产生显著增加，可以阻止DC激活抗原特异性T细胞的反应。敲除GILZ 的DCs 可增加CD4+和CD8+T 细胞中IFN-γ 和IL-17 的产生［25］。GILZ 尚可以调节DC 的抗原捕获和交叉呈递能力，调节抗原内化和提呈功能。此外，DC 中GILZ 过表达可促进细胞未成熟表型的形成和IL-10 的产生，同时抑制辅助性T 细胞中Th1、Th17 型细胞因子的分泌，从而有利于DC耐受表型的形成［15］。

在嗜中性粒细胞中，GILZ可通过ANXA1抑制中性粒细胞向炎症部位的迁移，抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成和炎症部位嗜中性粒细胞的聚集，也可诱导嗜中性粒细胞凋亡以减轻炎症反应［26］。在GILZ-KO 小鼠中复制的白色念珠菌感染或者急性结肠炎模型中，嗜中性粒细胞的状态呈现出更为活跃的表型，而野生型小鼠来源的细胞则表现出较低的活化程度［27］。在向成熟嗜中性粒细胞系分化的细胞系中，过表达的GILZ 通过激活JNK途径促进细胞凋亡［28］。在来源于急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）患者肺泡中的嗜中性粒细胞中，约75%经过GCs 治疗患者的中性粒细胞中GILZ表达上调［29］。

5.2 GILZ对适应性免疫的影响

在T 细胞中，GILZ 主要通过抑制T 细胞受体（T cell receptor，TCR）下游的信号转导途径发挥作用，包括MAPK-ERK、PI3K-AKT和NF-κB途径等［8，30］，这些途径均与控制TCR 触发后的细胞生长和炎症过程密切相关。抑制GILZ 的过度表达可以抑制与上述途径相关的抗CD3诱导的IL-2产生、IL-2受体的表达以及Fas和FasL 的上调，表明GILZ 可以抑制T 细胞的活化［31］。IL-2 是活化T 细胞的主要白细胞介素，通过抑制叉型头转录因子FoxO3调控GILZ 的表达中发挥作用［32］。此外，抗原诱导的T 细胞活化可以反过来降低GILZ的mRNA和蛋白质表达水平，再次表明GILZ 与T 细胞的活化密切相关。与GCs类似，GILZ 促进从Th1 到Th2 免疫应答的转换。在野生型小鼠中，过表达的GILZ转基因小鼠的CD4+T细胞产生更多的Th2型细胞因子（IL-4、IL-13）和更少的Th1 型细胞因子（IL-1β、IFN-γ）［33］。在Sjogren综合征小鼠模型中，GILZ过表达可抑制唾液腺细胞中IL-17 的产生；而在Th17 细胞活性增强的银屑病患者中，GILZ表达则为抑制状态［34-35］。

GILZ 还与Treg 的分化有关。我们知道，Treg 是在骨髓中积聚的T细胞亚群，通过调节免疫反应、维持对自身抗原的耐受性，防止自身免疫性疾病的发生。T 细胞中GILZ 敲除的小鼠可出现免疫稳态的丧失和自身免疫反应，其外周（而非胸腺）Treg 生成受损。采用化学方式诱导Th1 型结肠炎的发生，GILZ-KO 小鼠表现出更强的炎症易感性。GCs 治疗可增加野生型小鼠的Treg 数量和功能，减轻结肠炎症状；但GILZ 缺陷小鼠则无此反应，表明GCs 的免疫抑制作用至少部分依赖于GILZ，与其调控Treg的功能密切相关［36］。

GILZ 在骨髓、脾脏或其他外周器官的B 细胞中均高度表达。在骨髓细胞中，GILZ 在B 细胞发育的各阶段都有表达［16］。与T 细胞活化类似，B 细胞受体（B cell receptor，BCR）的活化可抑制GILZ 的表达，GILZ 下调则反过来促进B 细胞的活化［37］。在GILZ-KO 小鼠模型中，GILZ 介导GCs 对B 细胞生长和凋亡的调控作用消失［16］。敲除GILZ 小鼠的B 细胞中IFN-γ的产生增加，对炎症刺激的反应增强［19］。

6 GILZ 在自身免疫性疾病发生发展中的作用以及潜在应用价值

自身免疫性疾病是因机体免疫功能紊乱而出现的慢性疾病，严重危害人类的身体健康和生存质量。常见的自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、多发性硬化症等［38］。

来自系统性红斑狼疮患者的临床研究显示，人外周血单个核细胞、B 细胞中GILZ mRNA 呈现低表达状态，低表达程度与病情的严重程度呈负相关；经过GCs 治疗的患者其GILZ mRNA 表达显著增加［14，39］，表明GILZ表达降低程度与疾病的严重程度密切相关。在靶向纳米载体中输注含有编码GILZ mRNA 的纳米颗粒，该纳米药物可有效控制系统性红斑狼疮的疾病进展［40］。

在胶原诱导的风湿性关节炎小鼠模型中，GCs治疗能减轻模型小鼠的相关指标，GILZ的表达也随之改变。采用siRNA 沉默小鼠的GILZ，小鼠关节炎严重程度增加。在体外实验中，过表达GILZ则能抑制人类滑膜细胞中趋化因子和细胞因子产生。上述结果表明，GILZ 是关键的内源性调节分子，并可能成为类风湿关节炎的潜在治疗靶点［41］。

基于过表达GILZ 能减缓自身免疫性疾病的发生、减轻其严重程度的认识，人们制备了含有GILZ全长的融合蛋白TAT-GILZ。在二硝基苯磺酸诱导的结肠炎小鼠模型中，TAT-GILZ 通过抑制NF-κB的活化从而调控肠道中的CD4+T 细胞的功能，减轻了IL-10 基因敲除小鼠自发性结肠炎的严重程度［42］。在B 细胞条件性敲除GILZ 小鼠的结肠炎模型中，TAT-GILZ治疗3天即可逆转模型小鼠的结肠炎表现［19，43］。在急性肾损伤模型中，TAT-GILZ 能促进N2嗜中性粒细胞的生长，并抑制N1表型，恢复N1/N2平衡，从而有利于肾脏功能的恢复［44］。

在模拟人多发性硬化症的实验性脑脊髓炎小鼠模型中，采用来自GILZ 的多肽（具有富含脯氨酸的羧基端）进行治疗，结果发现多肽可以通过结合NF-κB p65 从而抑制前炎症细胞因子的表达、减轻疾病的严重程度［45］。

7 结语

近年来，为得到既保留GCs 的抗炎作用，又减少GCs 免疫抑制作用的药物，作为GCs 作用路径的下游分子，GILZ 受到了极大的关注。GILZ 的表达情况与自身免疫性疾病的发生发展密切相关，增加其表达或者补充该蛋白可有效降低自身免疫性疾病的严重程度。因此，深入研究GILZ的作用及其分子机制，有助于寻找替代GCs 用于治疗炎症性和自身免疫性疾病的药物。