酶联免疫吸附法、电化学发光法和荧光定量PCR法三种检验方式在丙型肝炎检验中的应用进展

崔欲晓 天津市东丽区疾病预防控制中心检验科 （天津 300300）

内容提要： 丙型肝炎（hepatitis C，HC）是丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染所致的一种疾病，在临床中主要表现为发热、恶心、厌食、关节疼痛、乏力等，具有易反复、慢性化、传染性等特点。酶联免疫吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、电化学发光法（electro-chemiluminescence immunoassay，ECLIA）和荧光定量聚合酶链式反应法（fluorescentquantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）是临床较为常用的三种检验方式，目前其应用于HC的研究也越来越多。因此，本文就近年来ELISA、ECLIA和FQ-PCR三种检验方式应用于HC的现状作一综述，旨在为HC的临床诊治提供更多参考。

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）在全球感染率已达3.2%且逐年升高，研究显示近80%患者可进展为丙型肝炎（hepatitis C，HC）[1]。HC治疗难度较高，初期临床症状不显著，患者未得到及时治疗很可能发展为肝癌，是导致患者死亡的重要原因之一[2]。目前临床常用的检测方法包括酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）电化学发光法（electro-chemiluminescence immunoassay，ECLIA）和荧光定量聚合酶链式反应法（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）[3,4]，为HC的防治提供了重要的参考。因此，本文对近年来HC患者应用ELISA、ECLIA和FQ-PCR进行展开综述，旨在提高HC患者生存质量。

1.检验方式

1.1 ELISA

ELISA敏感性和特异性均较高，但检验方式操作步骤较为复杂，且费用较高[5]。ELISA可分为间接法和双抗原夹心法[6]，间接法的原理是采用HCV抗原对固体载体进行包被，通过辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）对被检样品抗-HCV反应和抗人免疫球蛋白G（Immunoglobulin，IgG）进行标记，待底物邻苯二胺显色，即采用酶标仪判定结果的阴阳性[7]。间接法主要的反应过程为：向已包被的抗原反应孔中加入待测样本进行孵育，若标本中存在抗-HCV，则可与微孔抗原结合成为固相抗原抗体复合物；由于其他的免疫球蛋白和样品杂志无法结合固相抗原，因而可被洗涤洗去；将酶结合物加入其中孵育后使得其连接于抗原抗体复合物，洗涤后，可在3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物（3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine，TMB）参与的条件下出现显色反应，将终止液加入其中后，采用酶标仪对结果进行测量分析。双抗原夹心法的原理是借助纯化的抗-HCV抗体对微孔板进行包被，再将HCV抗原的肽片段加入微孔中，随后结合被HRP所标记过的HCV抗原成为抗原-抗体-酶标抗原复合物，彻底洗涤并加入TMB进行显色，最后采用酶标仪对结果进行判定[8]。双抗原夹心法主要的反应过程为：待样本和试剂恢复到室温后，向设置好的7个标准的样品孔中依次加入不同稀释比例的100μL标品，而零孔中则加100μL的标准品，对酶标板进行覆膜，在37°C下反应2h，行去液和甩干处理后，再加入100μL检测溶液1的工作液，于37°C反应1h，将孔内液体甩干后，在350μL洗涤液中浸泡1～2min，随后进行3次充分洗涤，注意在洗涤的最后一次需完全甩干孔内的洗涤液，在将100μL检测溶液2的工作液加入孔内，对酶标板覆膜并于37°C反应30min，在进行5次甩干和洗板操作，将90μL的底物溶液加入各孔，对酶标板进行覆膜后在避光、37°C条件下进行显色反应，待充分显色，即将终止液加入其中，最后采用酶标仪判定结果。

孙强等[9]分别采用双抗原夹心法和间接法对HCV抗体进行检测，结果显示两者检测的准确率具有显著的差异性，双抗原夹心法和间接法均可有效检测HCV抗体，但双抗原夹心法的特异性、灵敏度更高。分析其可能原因：双抗原夹心法能够检测IgG、免疫球蛋白M（Immunoglobulin，IgM）在内的总抗体，同时IgG亚型不会影响反应过程，对HCV感染窗口期的缩短有着重要的意义，进而提高早期感染的检出率，并且双抗原夹心法通过不同重组抗原对吖啶酯和生物素进行标记，能够减少非特异性的抗体和类风湿因子干扰，降低假阳性率。

ELISA发生假阳性现象可能因素：①注液量未达到要求、抽吸不全等不符合标准的操作；②患者原发病中存在超氧化物歧化酶、高免疫蛋白、类风湿因子等或血样溶血；③试剂：酶结合物、所克隆抗体纯度低于标准以及抗原不纯。

1.2 ECLIA

ECLIA主要是由电化学所引发的特异效果而产生的一种化学发光反应，在检测中能够自动稀释和重新检测[10]。ECLIA结合了高特异性免疫反应和高度灵敏化学发光的测定技术，在临床上广泛应用。通过竞争法对小分子的抗原进行检测，夹心法对大分子的抗原进行检测，非特异性的结合少；结合大分子后不影响光量产生，有利于提高灵敏度。ECLIA原理是通过联吡啶钌对病原体抗体或抗原免疫反应发生后的复合物进行标记，借助电场作用中电子传递将激发态转化为基态并发光。化学发光法属于分子发光广谱分析法中的一类，其主要依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，通过仪器检测待测物发光强度的痕量分析方法。除在临床检验医学中具有广泛应用外，在各类痕量金属离子、无机化合物、有机化合物及生物领域也有较高应用价值。化学发光是某种物质分子吸收化学能而产生的光辐射。任何一个化学发光反应都包括两个关键步骤，即化学激发和发光。因此，一个化学反应要成为发光反应，必须满足两个条件：第一：反应必须提供足够的能量（170～300KJ/mol），第二，这些化学能必须能被某种物质分子吸收而产生电子激发态，并且有足够的荧光量子产率。所研究的化学发光反应大多为氧化还原反应，且多为液相化学发光反应。

陈少彬等[11]分别采用ECLIA和ELISA对献血者抗-HCV进行检测，研究结果显示，两种检测方法有着高度的一致性，而在灵敏度方面，ECLIA更高。ECLIA假阳性率较高的原因分析为：①干扰：在检测过程中可能受类风湿类等其他抗体干扰；②标本状态：标本存在较多的纤维蛋白原、严重溶血、乳糜等。段金霞等[12]也在其相关研究中指出，ECLIA法对乙肝病毒的检测效能较ELISA法更好，但相比之下，ECLIA法的检测成本较ELISA法更高，或无法很好适应患者的临床需求。周明等[13]却表示，ELISA、ECLIA均有其自身优势、劣势，该研究中两种检测方式的检出率、敏感度、特异度均无明显差异，该学者建议可在充分结合临床实际基础上为不同患者选择合理的检测方法。

1.3 FQ-PCR

FQ-PCR作为一种新型分子生物学技术，是目前病毒核酸检测的最灵敏的直接检测手段，其在病毒载量很低时即可检测出。其检测最常用的是DNA结合染料SYBR Green Ⅰ的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法。理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。FQ-PCR的原理是将HCV编码区高度保守的区域视作靶区域，对荧光探针和特异性的引物进行设计，通过一步法逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）扩增，进而对血浆或血清样本HCV RNA进行定量检测，而HCV RNA阳性和病毒量含量能够表明病毒的存在及其传染性强弱和复制的活跃程度，对抗HCV和HCV RNA变化进行动态观察，能够有效判断HC预后以及评价其用药的临床疗效。与其他医学检验手段相比，FQ-PCR具有灵敏度高、特异性强、检测时间短等诸多优势，目前该技术在多种病原学检测、免疫疾病或肿瘤疾病的诊断中均有积极意义。

郭杰等[14]采用FQ-PCR对HC病毒核酸进行定量检测并评价其检测性能，研究结果表明FQ-PCR能够有效检测HCV RNA，且其正确度、精密度、线性范围、检测限、抗干扰的能力等均在临床要求以内。刘丽[15]也在其相关研究中表示，与ELISA等常见检测方法相比，FO-PCR的检测效率更高、结果更加准确。

FQ-PCR影响因素有：①保存：采用肝素抗凝标本对HCV RNA进行检测时，若Taq酶与样本残余肝素相结合即可引起Taq酶浓度的降低，对其活性产生了间接性的抑制作用，最终对PCR的检测结果产生影响；②前处理：HCV RNA PCR的扩增效果及准确性与核酸的提取方法有着直接的联系，而磁珠法可最大限度的减少核酸的丢失，进而使PCR反应中存在尽可能多的核酸标本；③其他：仪器设备的精密度、人员操作、环境的温湿度等也可能会对结果准确性产生影响，HCV的短期治疗，例如直接抗病毒药物治疗，可引起HCV RNA的迅速降低，导致其低于试剂的检测下限，引起假阴性结果的出现，同时核酸检测很容易被污染，则又会导致假阳性结果的出现。

2.小结及展望

目前检测HCV的方法主要有ELISA、ECLIA和FQ-PCR，但其均具有一定的局限性，因此提示临床可通过比较各种检测方法的优缺点，采用两种及两种以上检验方法以缩短检验的窗口期，降低漏诊率、假阴性率等，最终提高HCV感染的初期确诊率。另外HCV确认的检测成本较高，特别是核酸检测，其对操作人员和实验室的条件也有着较高的要求，大多数的实验室阳性检测结果报告只依赖于一次的初筛阳性实验结果，而并未进行更高特异性的核酸或血清学确证实验，故临床因重视病毒学的检测方案的建立和完善，开发出高效率、低成本的新的检测试剂或方法，同时对资源较为有限的地区的HCV基因的分型技术、核酸定量检测技术进行积极发展，进而提高检测结果的准确性，以为HCV病原体的地域分布、耐药位点的分布以及基因组的净化等研究提供一定的科学参考数据。