指纹汗液中吗啡的现场快速检测方法

陈 琦， 祁秋景， 郑新勇， 王 龙， 宋 昕*， 姚 丽*

(1.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥 230601； 2.合肥市公安局刑事科学技术研究所,安徽合肥 230001)

毒品是人类社会的公害。据《2019年中国毒品形式报告》指出，截至2019年底，中国仍有吸毒人员214.8万名，其中35岁以上109.5万名，占51%；18岁到35岁104.5万名，占48.7%；18岁以下7 151名，占0.3%。目前海洛因、冰毒、氯胺酮是三类主要滥用的品种。毒品滥用不仅会造成各种躯体、精神损害，还会导致疾病的传播，以及诱发刑事犯罪[1]。因此，建立准确而有效的毒品检测及监测技术具有重要的现实意义。

常见的毒品检测方法有化学检测法[2 - 4]、色谱法[5 - 7]、光谱法[8 - 13]、毛细管电泳法[14]、免疫法[15]。对于化学检测法，当待检物中毒品含量较低、或待检毒品中杂质不易去除，方法的精确度不能满足检测要求。色谱法虽是毒品分析中的确证性方法，但该检测必须在实验室完成，仪器成本较高，且样品前处理较为繁琐，检测耗时。光谱分析法主要包括红外和拉曼分析法，使用红外检测样品时，样品必须预先纯化，以保证有足够的纯度，因此红外在缉毒工作方面的使用具有一定的局限性。而拉曼的缺点在于不能探测混合物，对溶液的浓度有要求，对有色物体的检测不够准确。因此，我们需要建立一种方便、快速、精准的适于现场检测毒品的方法，便于缉毒工作的实施。

吗啡是海洛因在体内水解的重要产物，也是法医案件中检测海洛因含量的重要指标。因此，监测体内吗啡的含量可以有效判断其是否为海洛因的滥用者。目前吗啡检测的生物检材有血样、尿样、唾液、头发等。尿样的采集受到被采集人的配合程度、样品易被污染、易作假、涉及隐私等条件的限制。血液则需要专业人员的采集，样本易污染、易变质，且前处理复杂[16]。头发的采集，虽然与前两种方法相比，取样更为隐私，更易保存，但必须经过一定的提取步骤，对待检毒品有一定的损耗，不易检出真实含量。而无创取样，不涉及个人隐私的取样方式相比于其他的取样更易被大众接受。本文提出指纹采样并结合侧向免疫层析技术，仅在10 min内就能准确判断出嫌疑人是否吸食海洛因。该方法不仅取样方便，且检测快速准确，更重要的是适用缉毒工作者的现场稽查。

1 实验部分

1.1 主要试剂

氯金酸(百灵威科技有限公司)；柠檬酸三钠、碳酸钾、海藻糖、吐温20、曲拉通X-100、PEG 20000、pH=8.2的Tris-HCl、磷酸盐缓冲溶液(PBS)(国药集团化学试剂有限公司)；牛血清蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)、人血清蛋白(HSA)、酪蛋白钠(Na-Casein)(北京拜尔迪生物技术有限公司)；吗啡抗体、吗啡包被原、吗啡标准品(合肥市公安局业务技术用房)；羊抗鼠二抗(杭州贤至科技生物有限公司)；硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter，NC膜)、吸水垫、玻璃纤维膜、聚氯乙烯(Polyvinyl chloride，PVC)底板(上海捷宁科技生物有限公司)。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 主要仪器

XYZ-3试纸喷膜仪(美国，BIO DOT公司)；CM-4000试纸切条机(美国，BIO DOT公司)；IKA RCT basic加热磁力搅拌器(广州仪科实验室技术有限公司)；AL104电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；XT5118电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司)；LEGEND MICRO 17R低温高速离心机(德国，贺利氏公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 胶体金的制备本实验所使用的胶体金采用柠檬酸三钠还原法制备。将250 mL的锥形瓶和磁力搅拌子在王水中浸泡24 h后，使用自来水冲净，再向锥形瓶中加入2/3体积的水于310 ℃条件下煮沸后倒出，反复清洗5次。

在锥形瓶中依次加入60 mL水、850 μL 5 g/L的氯金酸，瓶口封上保鲜膜。将锥形瓶放在加热磁力搅拌器上，开启搅拌加热，待磁力搅拌子的运行状态稳定后停止搅拌。体系微沸后，重新开始进行搅拌，加入一定体积的1%柠檬酸三钠，至颜色稳定后(黑-紫-红)，5 min后关闭热源，15 min后关闭搅拌，自然冷却至室温后，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 胶体金与吗啡抗体的偶联取1 000 μL胶体金于1.5 mL体积的离心管中，加入一定体积的0.1 mol/L K2CO3将其pH值调整到合适值，加入一定量的1 mg/mL的吗啡抗体，涡旋混匀，于室温下孵育1 h，再加入100 μL的封闭剂，混匀，于室温下孵育1 h，进行封闭。封闭完成后，9 800 r/min、4 ℃条件下离心15 min，去上清，向沉淀中加入10 μL 10%的蔗糖溶液和70 μL 10%BSA的重悬液，涡旋混匀，即获得抗体-胶体金偶联物。使用移液枪吸取10 μL偶联物滴加于标记垫上，将其置于27 ℃的烘箱中，烘干备用。

1.3.3 侧向免疫层析试纸的制备试纸是由底板、样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫五个部分组成。样品垫切成18 mm×300 mm，置于样品垫处理液中浸泡2 h后，于27 ℃的烘箱中烘干备用。然后用喷膜仪将一定浓度的吗啡包被原和1 mg/mL羊抗鼠二抗喷于NC膜上作为T线和C线，将喷好的NC膜置于27 ℃烘箱中烘干备用。最后将样品垫、NC膜和吸水垫依次贴于PVC底板上，样品垫与NC膜之间留有2 mm的空隙用于后期组装金标垫，在切条机上将组装好的底板切割成6 mm宽的试纸，在干燥阴凉条件下保存备用。

1.4 吗啡试纸的实验参数优化

1.4.1 T线包被原浓度用喷膜仪分别将不同浓度的包被原(0.25、0.5、1、1.5 mg/mL)和1 mg/mL羊抗鼠二抗分别作为T线和C线喷于NC膜上，按照上述方法制备出吗啡试纸。取10 μL浓度分别为0、1、5、10、100 μg/L的吗啡标准品滴于手指上，待手指上溶液风干后，在手指上喷涂10 mmol/L的PBS，润湿手指，将手指按压在样品垫上，再向样品垫上滴加100 μL 10 mmol/L的PBS辅助样品迁移，最后根据显线结果确定T线上包被原的最佳浓度。

1.4.2 胶体金与吗啡抗体偶联前的pH一般来说，当金纳米粒子溶液的pH接近或稍高于抗体的等电点时，此时的抗体与金纳米粒子吸附作用最强。若pH过低，金纳米粒子会发生聚集，失去结合能力；若pH过高，抗体会带较强的负电荷，与胶体金互相排斥，因此合适的pH对抗体与胶体金结合至关重要。本实验在胶体金溶液中加入16、18、20、22 μL 0.1 mol/L K2CO3调节其pH，按照上述偶联方法制备金标垫。选择“1.4.1”优化的包被原的最佳浓度，制成试纸。取10 μL浓度分别为0、1、5、10、20 μg/L的吗啡按上述方法进行测试，最后根据试纸显线结果确定K2CO3的最佳体积。

1.4.3 抗体的标记量胶体金表面抗体的标记量是影响灵敏度的重要参数，抗体量太高，会增加消线难度，影响灵敏度；抗体量太低，则不利于C、T线的出线。因此，选择合适的抗体量至关重要。本实验用“1.4.2”优化的pH结果调节胶体金pH，然后于各管中分别加入1 mg/mL吗啡抗体0.8、1、1.2、1.4 μL，按照上述方法制成金标垫。选择1.4.1优化的包被原的最佳浓度，制成试纸。取10 μL浓度分别为0、1、5、10、20 μg/L的吗啡按照以上方法进行测试，最后根据显线结果确定偶联抗体量的最佳体积。

1.4.4 封闭剂封闭剂是用来封闭金纳米粒子表面未被抗体占据的位点，避免金纳米粒子表面裸露位点造成的非特异性吸附，因此合适的封闭剂对特异性结果至关重要。在选择用“1.4.2”优化结果的pH，以及“1.4.3”优化的抗体量的基础上，本实验选择4种封闭剂，分别是10%人血清蛋白(HSA)、0.5%酪蛋白钠(Casein-Na)、10%牛血清蛋白(BSA)、0.5%鸡卵白蛋白(OVA)，最后制成金标垫。选择“1.4.1”优化的包被原的最佳浓度，制成试纸。取10 μL浓度分别为0、1、5、10、20 μg/L的吗啡按照以上方法进行测试，最后根据显线结果确定最佳的封闭剂。

1.4.5 吗啡试纸灵敏度的检测使用最终优化好的试纸，取10 μL浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/L的吗啡标准品滴于手指上。待手指上溶液风干后，使用10 mmol/L的PB润湿手指，按压在样品垫上，滴加100 μL 10 mmol/L的PBS到样品垫上辅助样品迁移，10 min后，观察其显线结果。

1.4.6 吗啡试纸特异性的检测为了证明吗啡试纸仅对目标物吗啡响应，而不受其它物质干扰，采用与上述一致优化后的最佳试纸，分别对氯氮平、可卡因、四氢大麻酚、摇头丸、冰毒进行检测，使用阴性(10 mmol/L PBS)作为空白对照，10 min后观察试纸的显色结果。

2 结果与分析

2.1 吗啡试纸的检测原理

吗啡试纸的检测原理如图1所示。吗啡抗体与胶体金偶联制成金标偶联物，T线固定吗啡包被原，C线固定羊抗鼠二抗，建立竞争型侧向免疫层析试纸。海洛因吸食者的指纹汗液中含有吗啡，将吸毒者的手指按压在样品垫上，再加100 μL PBS，待测液在毛细作用下向前流动，经过金标垫，样品中的吗啡与金标垫上偶联物中的吗啡抗体结合，进而影响该抗体与T线上包被原的结合，所以此时T线不出线或显线减弱；抗体-胶体金偶联物继续向前迁移，与C线上固定的羊抗鼠二抗结合，显示红线。当未吸毒的正常受试者在样品垫上按下指纹，因向前层析的待测液中不含吗啡，故未与金标偶联物中抗体结合，流经T线时，与T线上固定的包被原结合，此时T线显红色；抗体-胶体金偶联物继续向前迁移，与C线上固定的羊抗鼠二抗结合，显示红线。因此，阴性条件下，吗啡试纸上显示两条红线；阳性条件下，T线减弱或消失，C线正常。

图1 吗啡快速检测试纸原理图Fig.1 Schematic of rapid lateral chromatography test strip for morphine

2.2 T线包被原浓度的选择

T线上喷涂的包被原浓度直接影响T线显色强度，故其对于胶体金试纸的检测灵敏度极为重要。本实验选择了包被原浓度0.25、0.5、1、1.5 mg/mL进行优化，检测结果如图2中所示。由实验结果可以看出T线上所喷包被原浓度为1 mg/mL时，在目标物浓度较低时T线即开始消线，灵敏度相较于其它3组稍高，且阴性条件下，T线颜色较深，因此T线上包被原的最佳浓度为1 mg/mL。

图2 吗啡包被原浓度的优化结果Fig.2 Optimization of morphine-BSA concentration

2.3 偶联体系的pH选择

偶联体系中K2CO3(0.1 mol/L)的体积影响抗体与胶体金的结合。本实验选择0.1 mol/L K2CO3的体积分别为16、18、20、22 μL进行实验考察。由检测结果(图3)可以看出，体系中K2CO3体积为18 μL时，C、T线整体显色清晰，且灵敏度相较于其它3组更高，阴性T线也相对较深，因此选择K2CO3的最佳体积为18 μL来调节胶体金的pH。

图3 pH的优化结果Fig.3 Optimization of pH

2.4 偶联抗体量的选择

选择合适的抗体量，能够提高试纸的灵敏度。本实验选择偶联抗体的体积分别为0.8、1、1.2、1.4 μL，考察最佳抗体用量。由实验结果(图4)可以看出，随着偶联抗体量的增加，相同浓度下试纸T线逐渐加深，灵敏度也逐渐降低。因此综合分析试纸T线颜色的强度和检测灵敏度，偶联抗体的最佳体积为1.2 μL。

图4 偶联抗体量的优化结果Fig.4 Optimization of the amount of conjugated antibody

2.5 封闭剂的选择

选择合适的封闭剂，能够有效消除裸露的金纳米粒子的非特异性吸附，提高检测的特异性。本实验选择了10%人血清蛋白(HSA)、0.5%酪蛋白钠(Casein-Na)、10%牛血清蛋白(BSA)、0.5%鸡卵白蛋白(OVA)4种封闭剂进行考察，由实验结果(图5)可以明显看出，综合考虑灵敏度和显色强度，最佳封闭剂为10%人血清蛋白。

图5 封闭剂的优化结果Fig.5 Optimization of the blocking buffer

2.6 灵敏度结果分析

根据优化后的最佳条件，使用建立的试纸检测方法对不同浓度的吗啡进行检测，检测结果如图6所示。其中图6a为试纸检测结果，可以看出随着吗啡浓度的增大，T线的强度也逐渐变浅，当上样浓度为2 μg/L(绝对量20 pg)时，与阴性结果相比其T线强度有明显的减弱；当吗啡浓度达到5 μg/L(绝对量50 pg)时，T线完全消失。此外，根据图6a中显线强度，用ImageJ软件对其进行灰度扫描，结果如图6c中所示，由结果可知，随着上样浓度的增大，T线峰值逐渐减小，趋势与可视化观察结果一致，在上样浓度为2 μg/L时，T线峰面积相比于阴性样本峰面积显著减小；且上样浓度为5 μg/L时，T线峰面积几乎为0。随后，根据6c图中T线峰面积与对应吗啡浓度建立线性关系，结果如图6b中所示，可以看出二者具有良好的线性关系，表明通过对图像的灰度扫描结果，可进一步对吗啡进行定量检测。

图6 吗啡试纸的线性检测结果Fig.6 Calibration curve of morphine test strip

2.7 特异性检测结果分析

为了确定吗啡试纸的特异性，本文选取了几种常见毒品，分别是氯氮平(CLO)、可卡因(COC)、四氢大麻酚(THC)、摇头丸(MDMA)、冰毒(MET)、吗啡(MOP)，以及上述几种毒品的混合样品进行检测，其中阴性对照采用PBS，结果如图7所示。由图7a可知，只有在样品中存在吗啡的情况下，T线才会消除，而对于其它几种毒品，其T线的强度几乎与空白样一致，表明建立的吗啡快速检测试纸对吗啡具有较好的选择性。进一步根据7a中T、C线处显线强度进行灰度扫描(图7c)，并根据T线峰面积进行量化分析(图7b)，结果与图7a一致，表明了吗啡试纸具有极好的特异性。

图7 吗啡试纸的特异性检测结果Fig.7 Specific test results of morphine test strip

3 结论

本文以胶体金作为标记物，在最佳条件下，无需进行复杂的预处理，即可构建一种能够在现场10 min内快速检测吸毒者指纹汗液中吗啡的侧向免疫层析技术。与文献报道的传统方法相比，吗啡侧向免疫层析试纸具有操作简单、检测快速的优势，且其可视化检测灵敏度低至20 pg，检测限为3.9 pg，可用于现场的快速检测。此外吗啡抗体的高特异性使吗啡试纸具有良好的选择性，仅对吗啡有信号响应。因此，本文建立的快速检测吗啡的方法为现场开展缉毒工作提供了可靠便捷的技术支撑。