超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道肼高分辨质谱快速筛查鱼类样品中的多肽抗生素

赵 静， 郭自国， 周天明， 高 进*， 余 静， 王 伟， 唐 澈， 王 倩

(1.湖北省农产品质量安全检测中心，湖北武汉 430070； 2.湖北省农业生态环境保护站，湖北武汉 430070)

杆菌肽(Bacitracin)、多粘菌素B(Polymyxin B)和硫酸粘菌素(Colistin sulfate)属于多肽类抗生素，它们不仅可预防和治疗动物疾病，还可以促生长，但滥用或不按照休药期使用也会在动物体内累积，通过食物链损坏人体神经系统和带来肾毒性等，甚至造成人体对细菌的耐药性。我国国家标准(GB 31650-2019)《食品中兽药最大残留限量》[1]中规定了牛、猪、家禽类组织、奶、蛋中杆菌肽限量为500 μg/kg；粘菌素在牛羊猪鸡的肌肉和肝中限量为150 μg/kg，肾脏中200 μg/kg，蛋中300 μg/kg，奶中50μg/kg。多肽类物质通常是大分子化合物，易被吸附，在提取过程中因样品的蛋白析出而基质效应明显，检测灵敏度低，一般前处理提取过程多要用到净化小柱、多倍浓缩再检测。发布的相关标准中规定了猪肉、猪肾[2,3]、牛奶、奶粉[4]、饲料[5]的检测方法，其中杆菌肽在猪肉、猪肾的检出限为50 μg/kg，牛奶中为50 μg/kg，奶粉中为250 μg/kg，饲料中为50 μg/kg，粘菌素在猪肉组织检出限为10 μg/kg，检测的方法主要有快检法、液相色谱法或液相色谱-质谱联用法。

目前标准和文献中关于鱼类样品中多肽类物质检测的报道很少。我国是水产品生产和消费大国，养殖过程中是否存在违规使用现象，需建立高效可靠的检测方法来评估，这对监管工作具有重要意义。本研究主要针对常规方法中灵敏度低，前处理复杂的难点，采用高分辨液-质联用技术[6,7]，利用精确质量数定性定量。该方法将样品简单提取后直接上机检测，不用过柱净化和浓缩，操作方便，数据可靠，极大提高了筛查效率。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

UPLC-Q/Exactive超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道肼高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher公司)；WH-3微型涡旋振荡器(上海楚定分析仪器有限公司)；CF16RN台式高速离心机(日立Hitachi公司)。

标准品：杆菌肽(纯度>84.8%)、多粘菌素B(纯度>88.1%)、硫酸粘菌素(纯度>95.1%)(德国Dr.E公司)。标准溶液的配制：准确称取适量标准品，用0.2%甲酸水溶液配制成1 000 μg/mL的标准储备溶液，置棕色容量瓶避光4 ℃避光保存。甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，美国J.T.Baker公司)；其他试剂均为分析纯；实验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 色谱/质谱条件

1.2.1 色谱条件色谱柱：hypersil gold C18柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序：0～1 min，A相90%保持不变；1～3 min，A相由90%线性变化至60%；3～5 min，A由60%线性变化至20%；5～7 min，A相20%保持不变；7～7.1 min，20%线性变化至90%；7.1～10 min，A相保持90%。柱温：30 ℃；流速：300 μL/min；运行时间：10.0 min。进样量：10 μL。

1.2.2 质谱条件电喷雾离子源(ESI)；正离子采集；离子源温度：300 ℃；毛细管温度：350 ℃；干燥气：氮气；鞘气压力：0.27 MPa；辅助气压力：0.07 MPa；喷雾电压：3 200 V；监测模式：SIM-dd-MS2;质谱扫描(一级)分辨率：R=70000;AGC target：5e4；最大注入时间：200 ms；隔离窗口：m/z2.0；(二级)分辨率：R=17 500；NEC为40 eV(50%)。3种多肽类化合物信息见表1。

表1 3种多肽类化合物的保留时间和精确质量数Table 1 Retention times and accurate masses of the 3 polypeptide compounds

1.3 样品前处理方法

准确称取2.00 g样品(±0.01g)，置于50 mL聚丙烯离心管，加入10 mL 1%甲酸化乙腈-水(体积比7∶3)，涡旋提取10 min，8 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm尼龙滤膜于PVC进样瓶，待测。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的选择

一般以乙腈作为提取溶剂可以沉淀蛋白和降低基质效应。多肽类抗生素极性强，酸性条件下稳定，所以选择酸化乙腈水溶液作为提取液，研究中发现随着提取液中水相比例增加，提取液乳化程度加重，如果乳化严重过膜难度增大，仪器易污染，应在保证提取效果下尽量减少水相比例。本实验考察了1%甲酸化乙腈和1%甲酸化乙腈-水溶液体积比分别为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5和4∶6的提取效果。粘菌素类提取效率随着水相比例增加而呈增加趋势，在8∶2的提取效率可以达到80%左右，7∶3的提取效率可达到90%左右，但在6∶4、5∶5和4∶6的提取液中随水相比例增加，提取液乳化程度增加，提取效率又会下降。杆菌肽提取效率在8∶2、7∶3、6∶4的体系中均有较好的提取效率，因此选用乙腈-水体积比为7∶3。

实验考察了体积比为7∶3的乙腈-水在不同酸度(0，0.5%，1%，2%，3%)的提取效果，杆菌肽提取没有显著区别，粘菌素类酸度在0，0.5%时提取率较低40%以下，在1%，2%，3%的提取效率接近,可达80以上，所以选用1%甲酸化乙腈-水(7∶3，体积比)作为提取液。

同时，研究中发现用普通玻璃进样瓶和选择水系滤膜时目标物被吸附，上机测定检不出目标物，进样瓶应选用PVC材质，滤膜应选用尼龙膜，不影响目标物的测定。

2.2 质谱条件的选择

多肽类大分子化合物，分子量均超过1 000，在正离子模式下，易生成单电荷、双电荷和三电荷多种带电荷分子离子。利用标准溶液在全扫描模式下得到待测物稳定并有较强的分子离子峰，杆菌肽([M+3H]3+)、多粘菌素([M-H2SO4+3H]3+)、硫酸粘菌素([M-H2SO4+3H]3+)强度最大，可选用一级SIM模式全扫，提取准分子离子理论精确质量数色谱图。理论精确质量数如表1所示,目标物相对质量偏差小于5.0×10-6。

2.3 色谱条件的选择

选用0.1%的甲酸水溶液分别和甲醇、乙腈作为流动相梯度洗脱测定目标物，如同其他文献中报道的，用甲醇作为流动相时，多粘菌素B和硫酸粘菌素峰型拖尾并且变形成多峰，用乙腈3种多肽类化合物都可获得对称的峰形，水相的酸度比较了0.1%和1%的结果，差异不大，可选择0.1%的甲酸水溶液和乙腈作为流动相洗脱。

2.4 基质效应考察

选用5种不同种类的鱼，按照“1.3”样品前处理方法分别制得5种空白基质溶液，再用空白基质溶液稀释混合标准溶液，分别配制5组混合标准工作溶液，上机测定。每种鱼中3种多肽类化合物的工作曲线浓度范围均为2.0～100.0 μg/L。基质标准工作曲线和溶剂标准工作曲线如表2。当基质工作曲线与溶剂工作曲线的斜率比η超出80%～120%范围时[6，8]说明基质效应明显，小于20%说明基质抑制较弱，大于50%说明基质效应强，均会影响结果的可靠性。结果表明，粘菌素类没有显著基质效应，但杆菌肽基质效应明显，所以为保证测定结果的可靠，出现阳性样品时，应采用对应品种空白样品溶液配制基质工作曲线进行定量。

表2 3种多肽类化合物一级母离子定量的标准曲线Table 2 Standard curves of the 3 polypeptide compounds with molecular ions

2.5 线性范围与检出限

用1%甲酸乙腈-水溶液(体积比，7∶3)作为提取液，用空白样品溶液分别配制2.0、5.0、10.0、20.0、50.0，100.0 μg/L的多肽类化合物的混合标准工作溶液进行测定，用一级母离子色谱峰面积(y)为纵坐标，对应浓度(x，μg/L)为横坐标绘制标准曲线，采用向空白样品中逐级降低加标浓度进行仪器测定的最低加标浓度为定量限。3种组分在2.0～100.0 μg/L质量浓度范围内呈良好线性关系，R2不低于0.995(表2)，定量限为10 μg/kg。

2.6 方法回收率和精密度

选用5类常食用的空白鱼样，分别添加10.0、20.0、50.0μg/kg 3个浓度水平的杆菌肽、多粘菌素B、硫酸粘菌素，每个添加浓度水平6次平行，计算回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表3。3个目标物的平均回收率为61.3%～113.9%，RSD为2.1%～14.3%。

表3 3种多肽类化合物的回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Recoveries(Re) and relative standard deviations(RSD)of the 3 polypeptide compounds(n=6)

2.7 实际样品的测定

采用本方法对市场抽检20份鱼类样品中3种多肽类物质进行测定，结果未检出阳性样品。

3 结论

本研究建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道肼高分辨质谱快速筛查鱼类样品三种多肽类物质的分析方法。该方法快速简单易操作，数据可靠，可用于鱼类样品的快速定性筛查和定量分析，为水产品质量安全监管提供技术支撑。