不同稻米基质发酵丛毛红曲菌MS-1代谢产物分析

刘 姣, 李妍依, 王 婧, 丁 华, 张 珣, 周有祥, 杨 洁

(湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所1，武汉 430064) (农产品营养品质与安全湖北省重点实验室2，武汉 430064)

红曲菌(Monascusspp.)是我国传统发酵食品的重要生产菌株，广泛应用于香肠、腐乳、红曲酒、红曲醋和肉制品的加工[1]。自1984年首个红曲菌被发现并命名以来[2]，目前已有至少19种红曲菌被发现并保藏[3, 4]，主要包括丛毛红曲菌(M.pilosus)、紫色红曲菌(M.purpureus)和红色红曲菌(M.ruber)等[5]。红曲菌可产生红曲色素(Monascuspigments, MPs)、莫纳可林 K(Monacolin K, MK)、γ-氨基丁酸等多种具有抗氧化、降血脂等功能的次级代谢产物，在食品着色剂、发酵剂和替代药物等领域应用前景广阔[6]。

红曲，又称红曲米(Red kojic rice)、丹曲，是红曲菌经过大米等淀粉原料发酵而成的传统的药食同源生物制品[7]。数据表明我国红曲产品年产量近万吨，相关产业产值达千亿元[8]。然而，部分红曲菌还可产生一种肾毒性真菌毒素——桔霉素(Citrinin，CIT)，限制了红曲产品的应用[9]。选用不产或低产CIT的红曲菌菌株进行红曲产品研发和功能成分挖掘是促进红曲产业发展的重要手段[10, 11]。因此，不产CIT且不具有CIT合成相关基因的丛毛红曲菌(M.pilosus) MS-1被广泛用于红曲米发酵[12, 13]。发酵基质对红曲菌代谢产物的产生具有重要影响[14, 15]。籼稻因其米饭具有疏松、黏性低、通气性好、易于操作等优点，一直是生产红曲米的重要原料[16, 17]。我国稻米资源丰富，占世界水稻资源的19.05%，也是世界上最大的水稻生产和消费国[18]。然而我国稻谷主要用于口粮，加工产品消费比例较低，稻谷资源合理化开发和高附加值利用问题日益突出[19]。

本研究将丛毛红曲菌(M.pilosus) MS-接种于不同籼稻米培养基中制作红曲米，分析比较红曲米中主要次级代谢产物含量差异，探究不同稻米基质品质差异对丛毛红曲菌MS-1代谢产物的影响，以期为安全高效红曲产品的开发和籼稻的高附加值利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

丛毛红曲菌(M.pilosus) MS-1为本实验室保藏。

1.1.2 试剂与培养基

甲醇、无水乙醇、盐酸 (36%)、氢氧化钠，均为分析纯；甲醇、乙腈、甲酸，均为色谱纯；Monacolin K标准品 (C24H36O5，CAS号75330-75-5，纯度98%)。

土豆葡萄糖培养基 (Potatodextrose agar medium, PDA)：土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，添加蒸馏水至1 L，用于活化红曲菌株。

米饭培养基：将大米浸泡3 h后晾干，称取15 g分装于100 mL三角瓶中用于红曲米的制备。所用6个品种为华占-Ⅰ、华占-Ⅲ、P7-1、HN19BX5、民丰B、5210S，对应编号为R1、R2、R3、R4、R5、R6。发酵后红曲米对应编号为MR1、MR2、MR3、MR4、MR5、MR6。所用培养基均于121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

8200全自动凯氏定氮仪，Fiastar 5000流动注射分析仪，ACQUITY HPLC液相色谱仪，ACQUITY UPLC高效液相色谱仪，7890A/5975C气相色谱质谱联用仪，U3900紫外可见分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 大米品质分析

参照标准NY/T 83—2017[20]、NY/T 593—2021[21]和GB 5009.5—2016[22]中描述的分析方法，分别测定6个品种稻米(R1～R6) 的出糙率、精米率、粒长、垩白粒率、胶稠度、含水量、直链淀粉含量及蛋白质含量。

1.3.2 Monacolin K标准曲线的制备

内酯型Monacolin K (MKL)：称取2.0 mg MK标准品，用75%乙醇溶液溶解并定容至10 mL，得到浓度为200 μg/mL的MKL标准溶液。

酸型Monacolin K (MKA)：称取2.0 mg MKL 标准品，用0.2 mol/L的NaOH溶液(75%乙醇溶液配制)溶解并定容至10 mL，50 ℃超声1 h后于室温静置1 h，得到浓度为200 μg/mL的MKA标准溶液。

标准曲线的制备：配制2、20、40、80、100 μg/mL梯度质量浓度的MKL及MKA标准工作液，经HPLC分析，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

1.3.3 红曲米的制备

将丛毛红曲菌MS-1接种于PDA斜面，28 ℃培养10 d，以 5 mL 无菌水洗涤活化菌株制备孢子悬液，经3层擦镜纸过滤去除菌丝，于显微镜下计数，并将孢子液稀释至 106个/mL。接种2 mL孢子液于米饭培养基中，28 ℃培养15 d后于45 ℃烘干，粉碎后装入密闭袋，避光冷藏备用。

1.3.4 红曲菌发酵产物分析

MPs分析：称取0.05 g红曲米粉于2 mL离心管中，加入1.5 mL甲醇溶液(80∶20)，高速涡旋1 min后，室温超声提取15 min，以12 000 r/min离心5 min，取出上清液，用紫外分光光度计分别于380、470、520 nm波长下测定红曲黄色素、橙色素和红色素色价。

MK分析：称取0.1 g样品于2 mL离心管中，加入1 mL乙醇溶液(75∶25)，高速涡旋1 min后，室温超声提取30 min，以12 000 r/min离心5 min，取出上清液，过 0.22 μm有机滤膜，滤液用于HPLC分析。HPLC分析条件列出如下：

色谱柱：TSKgel ODS-80Tm C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：35 ℃；流速：1 mL/min；检测器：紫外检测器；检测波长：238 nm；洗脱程序：0.1%甲酸水∶乙腈∶纯水(3∶ 60∶37) 等度洗脱20 min。

风味物质分析：称取1 g红曲米粉于20 mL顶空进样瓶中，加入2.5 g NaCl及5 mL蒸馏水，60 ℃条件下搅拌平衡15 min后用Supelco 50/30 um DVB萃取头萃取10 min，然后将萃取头插入气质联用仪进样口解吸7 min。按下述质谱条件进行分析，色谱柱升温程序：起始温度40 ℃，保持2.0 min，再以5 ℃/min升至120 ℃，保持时间3 min，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。顶空色谱条件：取样针120 ℃，载气15 psi，传输线150 ℃，恒温60 ℃，捕集阱Hi280 ℃，Lo 40 ℃；干吹5 min，捕集阱保持5 min，解析1.6 min。测得风味物质质量分数按式(1)计算：

(1)

式中：X为风味物质质量分数/%；AX为红曲米中测得的风味物质X的峰面积；A0为稻米中测得的风味物质X的峰面积；AS为红曲米中测得的所有物质峰面积之和。

1.3.5 数据分析

所有实验均重复测定 3 次，结果表示为平均值±标准偏差。使用SPSS 16.0 进行Duncan’s多重比较和相关性分析，所得数据经Z-score标准化后使用SIMCA 13.0 进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 稻米品质比较分析

高淀粉含量和蛋白质丰富的发酵基质有利于红曲菌次级代谢产物的合成[23, 24]，探究稻米品质不同造成的发酵基质差异对红曲菌发酵产物的影响，对6个品种稻米的出糙率、精米率、粒长、垩白粒率等外观品质和胶稠度、直链淀粉、蛋白质等理化性质进行了分析。由表1可知，6种稻米出糙率、精米率、粒长和水分含量相近，但垩白粒率、胶稠度、直链淀粉及蛋白质含量差别较大，变异系数均超过10%，说明6种稻米发酵基质差异显著。

表1 稻米品质分析

2.2 红曲米中代谢产物及风味物质分析

2.2.1 内脂式及酸式Monacolin K标准曲线的分析

将不同梯度质量浓度MKL及MKA标准工作液分别进行色谱分析，以峰面积为纵坐标(y)，MKL/MKA浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线。结果表明在0～100 μg/mL范围内，MKL及MKA的线性回归方程分别为y=24 837x-2 211.9和y=33 792x-6 913.1，相关系数R2分别为1和0.999 9，线性良好。

2.2.2 红曲米中MK及MPs含量分析

利用HPLC分析6种稻米基质发酵丛毛红曲菌MS-1所得红曲米中MKL及MKA含量及红曲黄色素、橙色素、红色素色价(图1)。由图1a可知，所得6种红曲米中MKA含量普遍高于MKL，图1b表明各样品中橙色素含量均低于黄色素和红色素。红曲米MR1中MKL和MKA的含量最高，红曲米MR5中MPs含量最高但MK含量相对较低。结果表明同种发酵基质发酵红曲菌，不同次级代谢产物含量变化趋势并不完全一致，这与前人研究结果一致[24, 25]。虽然高淀粉含量发酵基质有助于红曲菌次级代谢产物的产生，但MR4和MR6并未表现出较强的产MK和MPs的能力，原因还有待进一步分析。

注：同种产物中不同字母表示差异显著(P<0.05)。图1 不同红曲米中MK及MPs含量分析

2.2.3 红曲米中风味物质种类分析

将6个红曲米样品进行顶空固相微萃取后分析红曲米中风味物质。由表2可知，不同红曲米中风味物质种类和质量分数差异较大，所有红曲米样品中共检出14种风味物质，可分为酮类、醛类和酯类等多个类别，这与前人研究结果相似[26]。其中红曲米MR3中风味物质种类最多，共检出8种风味物质，主要成分为2-庚酮。红曲米MR6中仅检出1个风味物质，为棕榈酸甲酯。红曲菌在代谢过程中可产生多种酶类，因此广泛应用于传统发酵食品的酿造[27]。本研究初步分析了不同稻米基质发酵红曲米中的风味物质差异，后续进一步研究其代谢变化规律，可为探究红曲菌在酿造过程中的作用机制和贡献程度提供参考。

表2 不同红曲米中的风味物质分析

2.3 稻米基质对丛毛红曲菌MS-1代谢产物的影响分析

2.3.1 相关性分析

为探究不同稻米基质对丛毛红曲菌MS-1次级代谢产物的影响，进一步分析了稻米营养品质与丛毛红曲菌MS-1发酵产物的相关性。由表3可知，样品中MK含量与稻米各品质参数间相关性均不显著且相关系数较低。MPs含量与垩白粒率的相关性不显著但相关系数较高，说明大米垩白粒率可能影响MPs的合成。稻米垩白是由于稻谷灌浆不充分，导致胚乳中淀粉颗粒排列疏松、颗粒间存在间隙、淀粉颗粒排列不紧密造成的不透明部分[28]。从稻米基质本身淀粉结构及排列形式差异对红曲菌发酵产物的影响目前还鲜有研究，进一步分析不同垩白粒率稻米结构特性差异，有助于揭示稻米基质结构与红曲菌代谢产物的关系。此外，垩白是衡量稻米品质的重要性状[29]，垩白粒率偏高是我国稻米品质提升的主要限制因素之一。因此，以垩白粒率较高大米为红曲菌发酵基质，可为提高红曲菌代谢产物含量和增加低品质稻米附加值提供新思路。

表3 稻米品质与红曲米代谢产物的相关性分析

2.3.2 主成分分析

依据红曲米主要代谢产物含量及稻米基质品质参数为变量进行主成分分析。图2显示2个主成分累积方差贡献值达75.8%，可以反映6种红曲米的主要特征。由图2a可知，位于第4象限的红曲米MR5在第一主成分上得分最高，与图2b对应，MPs和壬醛也在第四象限呈聚集性分布，既说明了MPs和壬醛间的相关性，也说明MR5中MPs含量显著高于其他红曲米。位于第1象限的MR1在第2主成分上得分最高，对应载荷值较高的是MKA，表明MR1中MKA含量较高，同时也揭示了MKA和稻米胶稠度间的相关性。此外，载荷图还显示MPs、MKL、2-庚酮及壬醛含量均与稻米垩白粒率呈正相关。红曲米MR2、MR3、MR4和MR6聚集在一起，且距离MR1和MR5较远，说明这4个红曲米成分较为接近。

图2 主成分分析得分图(a)和载荷图(b)

主成分分析结果显示6种红曲米的主要代谢产物虽有明显差异，但与稻米直链淀粉和蛋白质含量并无直接相关性，这与前人研究结果相似[16]。可见，稻米基质本身蛋白质、直链淀粉等理化性质的含量差异可能不是影响红曲菌发酵的主要因素。前人研究表明，以碎米为发酵基质时MPs产量较高[25]，垩白对米饭断裂程度有显著影响，垩白度越高的稻米在蒸煮过程中越容易断裂。

3 结论

不同稻米基质发酵所得红曲米中代谢产物含量差异显著。红曲米MR1中MK含量最高约为340 μg/kg；红曲米MR5中MPs含量最高，红曲红、橙、黄色素色价均高于40 U/g；所试6种红曲米样品中共检出14种风味物质，红曲米MR3中风味物质种类最多。相关性分析及主成分分析结果显示稻米垩白粒率与红曲米主要代谢产物含量正相关但不显著。后续进一步分析不同垩白粒率稻米发酵过程中米粒断裂或蓬松程度、孔隙度和孔隙排列等结构特性有助于揭示稻米基质结构与红曲菌代谢产物的关系。