月泰贴脐片影响宫寒血瘀型肾虚不孕大鼠生育功能实验研究

詹燕珊 刘锐萍 罗 玺 覃楚悦 时 军,2*

1.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006；2.广东省局部精准递药制剂工程技术研究中心，广东 广州 510006

随着社会压力增大，生育年龄推迟，职业紧张度增加，女性的生育能力面临严峻的挑战，不孕不育发病率也呈现逐年上升的态势。根据中国第二次不孕不育患病率大规模调查，不孕不育的发生率为18%[1]。中医认为，宫寒血瘀肾虚型不孕症是由于肾阳不足、温补不足、气血瘀滞而导致的肾阳虚状态，导致脏腑生理功能受到抑制，子宫内生态环境低下[2]。如妇科名医罗元恺教授认为排卵障碍所致不孕者多属肾阳虚衰，病机关键为肾之阴阳消长转化异常[3]。在各脏腑中，肾与女子不孕症关系最为密切。若先天禀赋不足，房劳多产或过于劳累等，使肾虚血亏；而肾又为五脏阴阳之本，肾气虚推动无力，致宫寒血瘀，均可影响冲任，使肾虚不能摄精成孕[4]。

月泰贴脐片是选用延胡索、肉桂、细辛、当归、小茴香等中药组方而成，为深褐色药片，具芳香气味，外用于患者脐部(神阙穴)，每日1次，1次1贴；具有理气、止痛、活血化瘀和温经散寒的功效作用[5]，临床用于治疗宫寒血瘀引起的痛经、不孕等。为进一步揭示该方的作用机制，我们观察了该方对肾虚不孕症大鼠中血清促排卵(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)水平的影响，以期为其防治宫寒血瘀型肾虚不孕证提供科学数据。

1 实验材料

1.1 实验动物 SD大鼠(SPF级，90只，雌性60只，雄性30只，体重220～250 g，南方医科大学实验动物管理中心提供，合格证号：SCXK(粤)2016-0041。

1.2 试剂 羟基脲(批号：A13GS144627，上海源叶生物科技有限公司)，血清促排卵素试剂盒(批号：E-EL-R0391c)、黄体生成素试剂盒(批号E-EL-R0026c)、雌二醇试剂盒(批号：E-EL-0152c)均购自Elabscience。无水乙醇(批号：100092683)、二甲苯(批号：10023418)均购自国药集团化学试剂有限公司，HE染液套装(批号：G1003，Servicebio)，中性树胶(批号：10004160，国药集团化学试剂有限公司)；月泰贴脐片(批号：210301，烟台荣昌制药股份有限公司)

1.3 仪器 K3 TOUCH酶标仪(Thermo Fisher Scientific)；TGL-16R离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)；LRH-250生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；Donatello脱水机(DIAPATH)；JB-P5包埋机(武汉俊杰电子有限公司)；RM2016病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；JB-L5冻台(武汉俊杰电子有限公司)；KD-P组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；Giotto染色机(DIAPATH)；GFL-230烤箱(天津市莱玻瑞仪器设备有限公司)；Nikon Eclipse E100正置光学显微镜(日本尼康)。

2 方法

2.1 模型制备、干预方法及取材 肾虚不孕模型制备参照文献方法[6,10]，模型组及药物高、中、低剂量组大鼠每日早晨均给羟基脲(450 mg/kg)灌胃，持续15 d。肾虚模型建立标准：拱背，活动少，反应慢，体毛稀疏不亮，脱毛明显，肌肉松弛无力，食量减少。

在给大鼠灌胃的同时，对各组给予相应处理：随机将60只大鼠分为模型组(12只)，月泰贴脐片高、中、低剂量治疗组(各12只)，正常组(12只)。按照月泰贴脐片药品说明书0.55 g/(d·人)为标准，按照体表面积剂量换算法计算大鼠给药剂量。

选取大鼠脐部，标记(定位：神阙穴)，参考实验用大鼠经穴定位：脐部神阙穴位于腹部、胸剑联合与耻骨联合连线上8/13与下5/13位置处(胸剑联合下44 mm)[7]。将大鼠脐部局部剪去鼠毛，脐部给药后，使用医用创口贴外敷固定药物。高剂量组给予0.99 mg/(kg·日)；中剂量组给予0.495 mg/(kg·日)；低剂量组给予0.2475 mg/(kg·日)；正常组给予蒸馏水灌胃；模型组不进行额外干预。期间各组动物均正常饮食，自由饮水。第11天，各组雌鼠与雄鼠按比例2∶1[8]同笼4 d制备妊娠模型，第15天取出合笼的雄鼠，继续饲养7 d后，无菌条件下处死取血清，测定血清促排卵素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2);取得子宫，用10%多聚甲醛固定，后续选用HE染色法观察子宫组织的形态学改变。

2.2 观察指标及检测方法

2.2.1 观察指标 观察大鼠活动形态、毛发光泽、活动频率、纳食情况、大小便等。

2.2.2 大鼠受孕率 受孕率=受孕大鼠数/大鼠总数×100%[公式(1-1)]。

2.2.3 使用ELISA法检测各组雌鼠性激素含量 包括血清促排卵素、黄体生成素、雌二醇的含量。给药23 d后，所有组别的大鼠，均腹腔静脉取血，操作过程中使用不含内毒素的无菌试管，收集大鼠血清样品，依据说明书进行检测，并求出待测大鼠血清中相应激素的浓度。

2.2.4 常规子宫组织样本病理学研究 处死大鼠，收集子宫，固定于10%多聚甲醛，进行HE染色，光学显微镜下观察子宫组织的病理变化。

3 结果

3.1 月泰贴脐片对肾虚不孕模型大鼠一般情况的影响 正常组大鼠毛发油亮顺滑，活动灵敏，进食饮水及二便均正常。采用羟基脲灌胃15 d制备肾虚不孕模型后，模型组大鼠出现背部拱起，持续性萎靡不振，蜷缩少动，反应迟缓，体毛黯淡无光泽，进食量减少等肾虚症状。高剂量组可以减轻上述肾虚症状。

3.2 月泰贴脐片对肾虚不孕模型大鼠妊娠率的影响 正常组雌鼠在自由同笼法[8]同笼4d后受孕率可达100%。模型组受孕率为零，月泰贴脐片高中低给药组相比模型组可不同程度提高受孕率。结果见表1。

表1 各组大鼠受孕率比较

3.3 月泰贴脐片对各组大鼠血清FSH的影响 对大鼠血清中FSH含量进行测定，由图1可知，模型组FSH含量降低，和正常组比较有一定差异性(P<0.05)，证明模型组造模成功；与模型组比较，月泰贴脐片高剂量组对FSH表达有提高作用(P<0.05)，差异具有统计学意义。

L：低剂量组；M：中剂量组；H：高剂量组；X：模型组；K：正常组；与模型组比较，*P<0.05

3.4 月泰贴脐片对各组大鼠血清LH的影响 对大鼠血清中LH含量进行测定，由图2可知，模型组LH含量降低，和正常组比较有差异性(P<0.05)，证明模型组造模成功；与模型组比较，月泰贴脐片高剂量组对FSH表达有提高作用(P<0.05)，差异具有统计学意义。

L：低剂量组；M：中剂量组；H：高剂量组；X：模型组；K：正常组;与模型组比较，*P<0.05

3.5 月泰贴脐片对各组大鼠血清E2的影响 测定大鼠血清中E2含量，由图3可知，模型组E2含量降低，和正常组比较有差异性(P<0.05)，证明模型组造模成功；与模型组比较，月泰贴脐片高剂量组对E2表达有提高作用(P<0.05)，差异具有统计学意义。

L：低剂量组；M：中剂量组；H：高剂量组；X：模型组；K：正常组；与模型组比较，*P<0.05

3.6 月泰贴脐片对肾虚不孕模型大鼠子宫形态的影响 肉眼观察，可以观察到正常组大鼠子宫较厚，颜色鲜红，血管丰富；模型组子宫小，内壁薄，色泽苍白发黄；与模型组比较，月泰贴脐片给药组子宫形态均有不同程度的改善，且高剂量组可达到正常组相近水平，子宫血液循环较为顺畅，血流量较多。

光学显微镜下可见，正常组子宫内膜细胞排列紧密，固有层子宫腺丰富，卵泡发育良好，卵泡数目多，胶原丰富，结构紧密，间质细胞呈类圆形，肌层肌纤维排列紧密。与正常组比较，模型组子宫内膜上皮呈现不规则凹陷，且子宫肌层较薄，常见一些闭锁卵泡和原始卵泡，几乎不见成熟卵泡。高剂量组局部内膜上皮细胞增生，上皮增厚，子宫腺数量增多，卵泡发育较好，胶原增多，结构较为紧密，间质细胞数量增多，局部密度增大。中剂量组子宫内膜上皮较为均匀，间质细胞数量均匀增多，密度略增大，卵泡数量相比正常组较少，原始卵泡较多。低剂量组相比正常组卵泡数量较少，子宫病理形态改善情况不明显。如图4。

4 讨论

中医学认为肾者主水，受五脏六腑之精而藏之。即肾藏精，主生殖，为生命之源，元气之根，而精作为构成人体的物质基础，肾气充，才能使生殖之精成熟，阴阳之精相合，从而孕育胎儿[9]。根据当代中医研究报道，在正常排卵和孕育中，肾精的作用机制，可类比于现代医学“下丘脑-垂体-卵巢-子宫轴”中下丘脑的作用[10]，其功能紊乱会导致性腺轴激素分泌不足，是造成不孕的常见诱因[11]。因此通过调节机体性激素，可以促进输卵管卵泡发育，促进胚胎着床，提高受孕率。

图4 月泰贴脐片对肾虚不孕模型大鼠子宫形态的影响图(HE，×200)

月泰贴脐片由醋延胡索、肉桂、细辛、当归、小茴香等药物组成。方中君药醋延胡索具活血行气止痛之功[12]；臣药肉桂和细辛可补火助阳、散寒止痛、活血调经，共达强肾培阳的功效，使胞宫得以濡养温煦[13-14]；当归、小茴香补血调经、活血行气以补肾活血化瘀[15-16]。诸药合用，既能补肾暖宫，止痛化瘀，又各司其职，并行不悖，使寒凝血瘀的子宫和虚寒的肾脏得以恢复其精气。

研究中采用羟基脲灌胃制备宫寒血瘀型肾虚不孕大鼠模型，模型大鼠出现持续性萎靡不振，背毛不整，毛色不光亮不光洁，食少纳呆，饮水增多，大便增多，粪质变稀软，反应迟缓，扎堆趴窝等现象，符合宫寒血瘀症状，且模型组受孕率为零，提示宫寒血瘀型肾虚不孕大鼠模型制备成功。在大鼠脐部黏贴月泰贴脐片，可改善上述症状，并提高大鼠受孕率。基于病理学结果，提示月泰贴脐片治疗宫寒血瘀型大鼠的形态学基础与改善子宫的病理形态密切相关，包括促进子宫内膜增生，增加子宫内卵泡数量，促进卵泡成熟等子宫形态改变，从而改善胚胎着床环境。研究表明，对于宫寒血瘀模型大鼠，月泰贴脐片可改善其子宫内膜形态，这和性腺轴激素(FSH、LH、E2)等变化有着紧密联系。月泰贴脐片高剂量组和模型组相比，可提高大鼠中FSH、LH、E2的含量，提示月泰贴脐片通过提高性激素含量以促进胚胎着床，提高受孕率。