HDAC1、MAPK水平与慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者糖皮质激素抵抗的关系

刘春苗，牛春生，杨强

（天津医科大学宝坻临床学院，天津市宝坻区人民医院耳鼻喉科，天津 301800）

慢性鼻-鼻窦炎（CRS）是一种发生于鼻腔及鼻窦黏膜的慢性炎症疾病，慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）是CRS较为严重的一种，可引发严重的头痛、流涕、嗅觉丧失、鼻塞等症状，对患者生活质量和身体健康具有较大影响[1]。糖皮质激素（GC）是临床治疗CRSwNP的首选抗炎药物，对改善患者临床症状疗效较好，但部分患者对GC治疗不敏感，临床称之为GC抵抗，GC抵抗的发生会直接影响GC的治疗效果，因此，了解影响GC抵抗发生的危险因素具有重要临床意义[2-3]。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）属于去乙酰化酶超家族，组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）是HDACs中研究较多的一种，其水平的高低可反映组蛋白乙酰转移酶（HAT）和HDAC的动态平衡，HDACs主要分布于细胞核中，参与机体炎症，可通过调节核因子（NF）-κB信号通路、Toll样受体4（TLR4）-MyD88信号通路发挥抗炎作用，其中组蛋白修饰是重要组成成分，组蛋白乙酰化/去乙酰化与基因活化密切相关[4]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要包括细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun N末端蛋白激酶（JNK）、p38MAPK 3个亚型，其信号通路主要存在于细胞内，可将细胞外的刺激信号转导至细胞核，参与细胞炎症、增殖、转化、分化及凋亡等多种生物学反应[5]。段甦等[6]通过RT-PCR及免疫组化染色检查发现HDAC1 mRNA及蛋白表达在鼻窦炎伴鼻息肉患者鼻息肉中表达上调。同时王彤等[7]对单纯CRS及CRSwNP患者MAPK信号通路进行检测，显示MAPK通路对鼻黏膜上皮细胞增殖作用在CRS中减弱。近年来有研究指出，HDAC1和MAPK在临床中存在一定相关性[8]，因此笔者探讨HDAC1、MAPK信号传导通路中ERK、JNK、p38MAPK水平在预测CRSwNP患者GC抵抗中的价值。

1 对象与方法

1.1 一般资料 选取2018年10月—2020年10月收治的CRSwNP患者60例，根据患者是否存在GC抵抗分为GC抵抗组（n=22）和GC敏感组（n=38），其中GC抵抗组男12例，女10例；年龄25~69岁，平均年龄（38.45±2.31）岁；体重指数（BMI）为19~26 kg/m2，平均BMI（23.56±2.10）kg/m2；GC敏感组男21例，女17例；年龄25~68岁，平均年龄（38.15±2.05）岁；BMI为19~26 kg/m2，平均BMI（23.91±2.34）kg/m2。性别、年龄、BMI两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。已获院医学伦理委员会批准（2018-7号）。诊断标准：符合《慢性鼻-鼻窦炎诊断治疗指南》[9]中CRSwNP诊断标准。入选标准：（1）符合CRSwNP诊断标准。（2）年龄≥18岁。（3）入组前3个月未接受GC治疗。（4）签署知情同意书。排除标准：（1）变应性鼻炎。（2）免疫缺陷者。（3）合并严重肝、肺、肾及心血管疾病。

1.2 方法（1）GC抵抗标准：鼻内镜下钳夹活检法取治疗前组织标本。给予甲泼尼龙（天津天药药业股份有限公司，国药准字：H20020224）口服，剂量为24 mg/次，1次/d，持续治疗1周后取鼻息肉组织作为GC治疗后的样本。对比治疗前后样本，采用鼻内镜下息肉Lured-Kennedy改良鼻内镜评分[8]评估患者对GC治疗的反应，Lured-Kennedy共评估6项，每项0~2分，总分为12分，其中Lured-Kennedy评分改善≥1分为GC敏感，否则为GC抵抗。（2）mRNA检测：常规Trizol（购自美国Invitrogen公司）提取总细胞中RNA，以荧光实时定量反转录聚合酶链反应（VQ-RT-PCR）逆转录cDNA测定HDAC1 mRNA。VQ-RT-PCR反应体系：5×定量PCR缓冲液10 μL，上游引物、下游引物、荧光探针各（10 pmol/μL）1 μL，ddH2O 30 μL，cDNA 5 μL，Taq酶（2 U/μL）1.5 μL，总体积：50 μL。反应条件：3 min 93℃，45 s 93℃，45 s 55℃，共40个循环。反应结束后由计算机对荧光信号进行处理并绘制标准曲线，样本结果以相对循环阈值法由计算机读出。VQ-RT-PCR试剂盒由德国Qiagen公司提供，以Primer Premier 5.0软件设计引物，采用β-actin和GA PDH进行双内参校正。HDAC1引物和探针由美国ABI公司设计合成，治疗前后测定。MAPK相关指标测定：取GC治疗前、后的鼻息肉组织，采用VQ-RT-PCR检测p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA表达量，测定流程同HDAC1 mRNA。VQ-RT-PCR引物序列表见表1。

表1 VQ-RT-PCR引物序列表Tab 1 VQ-RT-PCR primer sequence list

1.3 统计学处理 选用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用Kolmogorov-Smirnov法检验正态性，正态分布资料按±s表示，两两比较行t检验；偏态分布资料采用中位数[M（Q1～Q3）]表示，两两比较行秩和检验；计数资料以（%）表示，组间行χ2检验；利用受试者工作特征（ROC）曲线分析HDAC1 mRNA、p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA对CRSwNP患者GC抵抗发生的预测价值，多因素分析采取非条件Logistic逐步回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组HDAC1、p38MAPK、ERK、JNK mRNA水平比较 治疗前两组各指标水平比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。治疗后GC抵抗组HDAC1 mRNA表达量显著低于GC敏感组，p38MAPK、ERK、JNK mRNA表达量显著高于GC敏感组（均P＜0.05），见表2。

表2 两组HDAC1、p38MAPK、ERK、JNK mRNA比较（±s）Tab 2 Comparison of HDAC1 mRNA，p38MAPK mRNA，ERK mRNA and JNK mRNA between the two groups（±s）

表2 两组HDAC1、p38MAPK、ERK、JNK mRNA比较（±s）Tab 2 Comparison of HDAC1 mRNA，p38MAPK mRNA，ERK mRNA and JNK mRNA between the two groups（±s）

注：GC：糖皮质激素；HDAC1：组蛋白去乙酰化酶1；p38 MAPK：p38丝裂原活化蛋白激酶；ERK：细胞外信号调节蛋白激酶；JNK：c-Jun N末端蛋白激酶

GC敏感组（n=38）HDAC1 治疗前 0.33±0.02 0.34±0.04治疗后 0.55±0.03 0.84±0.07 p38 MAPK治疗前 0.74±0.07 0.76±0.06项目 时点 GC抵抗组（n=22）t P 0.279 0.000 0.247治疗后 0.56±0.04 0.32±0.05 19.213 0.000 ERK 治疗前 0.91±0.07 0.93±0.08 0.975 0.333治疗后 0.78±0.06 0.51±0.05 18.721 0.000 JNK 治疗前 0.89±0.07 0.87±0.06 1.170 0.247治疗后 0.67±0.08 0.34±0.05 19.694 0.000 1.093 18.425 1.170

2.2 HDAC1 mRNA、p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA预测CRSwNP患者GC抵抗发生的ROC曲线分析 经ROC曲线分析，HDAC1 mRNA、p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA预 测CRSwNP患者GC抵抗发生的曲线下面积分别为0.715、0.917、0.863、0.885，均P＜0.05，见表3。HDAC1 mRNA、p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA预测CRSwNP患者GC抵抗发生的ROC曲线见图1。

表3 HDAC1 mRNA、p38MAPK mRNA、ERK mRNA、JNK mRNA预测CRSwNP患者GC抵抗发生的ROC分析Tab 3 ROC analysis of HDAC1 mRNA，p38MAPK mRNA，ERK mRNA and JNK mRNA predicting the occurrence of GC resistance in patients with CRSwNP

图1 HDAC1、p38MAPK、ERK、JNK mRNA预测CRSwNP患者GC抵抗发生的ROC曲线Fig 1 ROC curve of HDAC1 mRNA,p38MAPK mRNA,ERK mRNA and JNK mRNA predicting the occurrence of GC resistance in patients with CRSwNP

2.3 CRSwNP患者GC抵抗发生的多因素Logistic回归分析 将有差异的单因素纳入Logistic模型，行量化赋值，因变量为是否发生GC抵抗（是=1，否=0），自变量为HDAC1 mRNA（＜0.660=1，≥0.660=0）、p38MAPK mRNA（≥0.428=1，＜0.428=0）、ERK mRNA（≥0.571=1，＜0.571=0）、JNK mRNA（≥0.510=1，＜0.510=0）。经多因素Logistic回归分析证实，HDAC1 mRNA＜0.660、p38MAPK mRNA≥0.428、ERK mRNA≥0.571、JNK mRNA≥0.510是CRSwNP患者GC抵抗发生的危险因素，均P＜0.05，见表4。

表4 CRSwNP患者GC抵抗发生的多因素Logistic回归分析Tab 4 Multivariate Logistic regression analysis of GC resistance in patients with CRSwNP

3 讨论

GC的抗炎效果由糖皮质激素受体（GR）介导，GR主要有GRα和GRβ两种亚型，GRα含量在鼻黏膜中远大于GRβ，其中GRα活化后可与GC结合产生GR-GC复合物，复合物转移至细胞核中以同源二聚体形式与靶基因中GC反应元件结合，在其他辅助因子参与下改变靶基因染色体，使其发生重构并激活靶基因转录来发挥抗感染、抗炎、抑制免疫等生物学效应[10-11]。而GRβ无法与GC结合，但可竞争性与GRα结合生成异源二聚体来减少GR-GC复合物的产生，同时抑制GRα活性，以此降低GC的抗炎效果，因此，GRα/GRβ比值降低是GC抵抗发生的重要原因[12]。另外，GR可与其他转录因子如NF-κB、活化蛋白1（AP-1）相互作用，抑制炎性基因转录，从而抑制炎症因子产生[13]。

本研究中，GC抵抗组HDAC1 mRNA显著低于GC敏感组，p38MAPK、ERK、JNK mRNA表达量显著高于GC敏感组，提示上述因素可能是导致CRSwNP患者GC抵抗发生的影响因素。组蛋白乙酰化由HAT和HDAC共同调节，当机体HDAC1表达量下降，HAT和HDAC动态平衡被打破，组蛋白过乙酰化，致使细胞内炎症相关基因转录增多，炎症蛋白合成增加，阻断了GC抗炎效果[14-15]；HDAC1表达量下降还可使去乙酰化的NF-κB乙酰化，激发NF-κB活性，导致活化的GC与GRα结合的反应元件能力下降，使GC抗炎作用下降，从而引发GC抵抗[16-17]。

MAPK信号通路可参与上游信号转导途径，参与GR亚型的合成，使GRα/GRβ比值发生改变，促使GC抵抗发生[18]。同时MAPK信号通路被不同的细胞外和细胞内刺激激活，如氧化应激、内质网应激等，因此MAPK信号通路可以此调节细胞炎症、应激、分化、生长等病理和生理过程[19]。MAPK信号通路可被细菌病原体、促炎因子等激活，激活后的MAPK信号通路可从脂质进入细胞核，促使NF-KB活化，并调节相关基因表达来参与机体炎症反应，促使促炎因子如白介素、肿瘤坏死因子α等产生，诱发GC抵抗[20]。

经多因素Logistic回归分析及ROC分析证实，HDAC1 mRNA＜0.660、p38MAPK mRNA≥0.428、ERK mRNA≥0.571、JNK mRNA≥0.510是CRSwNP患者GC抵抗发生的危险因素。因此，采用GC对CRSwNP患者进行治疗时，临床需对上述因素予以关注，异常者及时采取相应措施，降低GC抵抗发生。

综上，CRSwNP患者GC抵抗发生的机制较为复杂，HDAC1及MAPK可直接或间接参与机体许多生理反应过程，在GC抵抗发生中起重要作用。