猪回肠炎免疫反应及免疫保护研究进展

程兰玲，李俊辉，张 伟，贺 笋

（天康生物制药有限公司，新疆 乌鲁木齐 830011）

猪回肠炎 (Porcine proliferative enteropathy，PPE)是由一种重要的革兰氏阴性胞内劳森菌(Lawsonia Intracellularis，LI)引起，以回肠和结肠隐窝内未成熟的肠细胞发生腺瘤样增生为主要病理特征的接触性肠道传染病，主要引起4～20周龄的生长育肥猪出现腹泻、贫血、食欲下降和生长缓慢等临床症状。潜伏期一般为 2～3周。是在各种养殖条件下均可出现的一种世界性疾病[1]。

1 胞内劳森菌的感染研究

1.1 组织毒感染

胞内劳森菌是一种胞内寄生细菌，猪感染发病后影响农场的生产力和养殖效益。在野外条件下，细菌活化的精确分子机制和PPE发生所需的环境条件仍然是未知的。Boutrup等人[2]通过实验性感染5周龄猪108CFU/mL的组织毒（刮取感染的肠黏膜），研究了早期发病机制。研究结果表明，感染后12 h，细菌感染小肠上皮细胞；感染后36 h形成离散灶，感染第5日（5 dpi，days post-infection）， 在重度感染隐窝周围的固有膜中可以检测到细菌。

1.2 细胞内培养物感染

Macintyre等人[3]用2×108CFU/mL的细胞内纯培养物感染7周的仔猪，一半的感染动物表现出隐窝上皮增生，在感染第7日的隐窝上皮细胞之间有嗜中性粒细胞浸润，但是在隐窝固有层没有明显的炎症反应。感染第11日，在增生隐窝上皮细胞的细胞质和固有层的单核细胞胞浆中检测到大量的胞内劳森菌。

虽然从感染第5日开始就在黏膜固有层单核细胞中检测到细菌，但是在感染第11日没有明显的炎症迹象，这表明先天性和适应性免疫反应要么是延迟的，要么是非常温和的。在感染的早期，胞内劳森菌避开了先天性免疫细胞和细胞因子的直接作用，进入细胞内的细菌在小肠腔内繁殖，在共生竞争中生存，并穿过黏液屏障感染宿主细胞。

2 不同感染时期免疫应答

2.1 感染后1～14 d，胞内劳森菌感染引起的早期黏膜免疫应答

猪回肠炎主要有猪小肠腺瘤病（Porcine intestinal adenomatosis,PIA）和增生性出血肠病（Proliferative haemorrhagic enteropathy,PHE）两种不同的形式。在PIA与PHE两种形式的回肠中，通过显微镜均可观察到未成熟细胞增殖、杯状细胞缺失和正常的隐窝细胞分化紊乱等显微结构改变。PHE形式的回肠中，还有黏膜IgA滴度和细胞因子的产生延迟，这可能有助于细菌向固有层的扩散[4]。先天性和适应性免疫反应被延迟或非常温和，可能是由于细菌的免疫抑制作用。感染胞内劳森菌5 d后，在重度感染隐窝周围的固有膜中检测到细菌；感染11 d后，在增生隐窝上皮细胞的胞浆和固有层单核细胞的胞质中可见大量的胞内劳森菌。在PHE形式的回肠中，急性回肠炎的主要特征是炎症和黏膜出血，巨噬细胞和中性粒细胞浸润并分泌炎性细胞因子进入固有层，导致动物的特征性症状和死亡[5]。

2.2 感染后14～42 d，发病中期胞内劳森菌感染产生的免疫反应

感染14～25 d，细胞内感染胞内劳森菌的猪小肠腺瘤病形式的黏膜免疫反应主要表现为感染高峰期未成熟细胞过度增殖，杯状细胞缺失、巨噬细胞和树突状细胞增加的微观变化。

感染胞内劳森菌后，从5～10 d时TNFα分泌增加，感染10～20 d时IFNγ、IL-6分泌增加；第20日时，抗炎细胞因子IL-4和TGFβ水平降低，第25日血清中IL-10水平降低[6]。细胞因子以 IFNγ、TNFα和IL-6分泌增加为主，IL-10，IL-4和TGFβ的血清浓度降低。

尽管IL-10、IL-4和TGFβ浓度降低，但是局部体液免疫反应被激活，感染15 d后特异性IgA分泌增加，在感染高峰的末期，免疫反应的调节臂开始启动，感染20 d后血清中分泌TGFβ；感染25 d后分泌IL-8和IL-10。当感染第42日时，感染消退，黏膜固有层CD3+细胞明显减少[7]。

到感染第15日，细菌在小肠和大肠扩散，回肠、盲肠、结肠以及空肠上皮细胞增生。在此期间，在回肠和空肠固有层、十二指肠、结肠、盲肠和直肠的隐窝细胞的管腔和胞浆中，以及近端结肠黏膜下层的淋巴结中都检测到了细菌抗原。这些发现表明，胞内劳森菌能够在不受免疫系统约束的情况下在肠黏膜上传播。在此期间，细菌被固有层的抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)吸收，并被淋巴组织中的淋巴细胞提呈，从而引发抗原特异性的适应性免疫反应[8]。感染第19～24天，空肠黏膜组织病理学增加明显，到感染第29天，大多数细菌从肠上皮细胞被清除，细菌抗原主要在固有层的单核细胞的细胞质中被检测到[9]。

从感染第35～42天，在感染消退的肠切片中没有检测到组织学损伤或胞内劳森菌抗原。在感染42 d后，感染消退的特点是固有层CD3+细胞数量显著减少，绒毛中CD8+细胞明显减少[8]。此外，MHC-II染色显示，在感染42 d后，部分固有层的MHC-II+染色总量少。总之，这些数据表明适应性免疫反应至少被延迟到感染后14 d，这可能有助于细菌的增殖和扩散到整个肠道[5]。

诱导后天免疫系统产生的细胞免疫和体液免疫，分别通过IFNγ分泌细胞和IgA反应的升高来呈现。在感染的后半段，TGFβ和IL-10水平升高，这两种细胞因子在抑制过度炎症、下调炎症促进因子，以及促进肠上皮完整性方面起着重要的调节作用。这些数据表明，要想成功地解决胞内劳森菌感染，需要充分和及时地激活炎症促进因子和调节性细胞因子，以提供免疫保护[6]。

3 感染后免疫保护

3.1 疫苗免疫

目前，有两种已经注册的针对胞内劳森菌的疫苗，用于预防猪场的猪回肠炎疾病。第一个注册疫苗是某某格公司的产品，是一种活的细菌分离物B3903，在mccoy细胞中传20～40代，使其致弱无毒[10]。一项研究结果表明，与未接种疫苗的对照组相比，接种肠道疫苗的猪在接受强毒性细菌攻击时，只受到部分保护，肠道损伤明显减少，没有临床症状，日增重也较为明显。弱毒表现为细菌细胞代谢和毒力基因的下调[11]。

市场上第二种可用于治疗胞内劳森菌的疫苗是某公司的产品，它是由灭活的全细胞细菌与由矿物质油和α-生育酚（维生素E）组成的佐剂配制而成。一项研究表明，对22～25 d断奶前仔猪免疫接种灭活疫苗，然后用感染性细菌攻毒[12]，可以显著提高血清抗体滴度，细菌排泄物减少15倍，减少了回肠的微小损伤，保持了肠道的完整性。

3.2 疫苗试验疗效评估

Jacobs等[13]通过两项试验性接种胞内劳森菌疫苗，评估其使用效果，组Ⅰ是在试验性感染条件下，采用皮内注射胞内劳森菌灭活疫苗与口服市售的胞内劳森菌活疫苗的方法，分别单独免疫3周龄猪，7周龄攻毒感染，攻毒后2 d观察结果；组Ⅱ是在田间条件下，采用PCV混合的胞内劳森菌皮内注射疫苗的方法免疫81～129日龄猪，24周龄时感染攻毒，25周龄剖杀，并分别设置未免疫组作为阴性对照组。感染攻毒后，通过临床症状、平均日增重、排出物及肉眼与显微微观免疫组织的回肠损伤评分。在田间试验研究中，死亡率与关键性能参数评估超过8个月时间。研究结果显示，胞内劳森菌皮下注射疫苗与混合PCV皮下注射免疫疫苗，无论是单独免疫还是混合免疫，对于胞内劳森菌的感染都诱导了明显的保护作用。与阴性对照组相比，显示出了更低的临床得分及明显的增重，减少了胞内劳森菌的排放及肉眼可观的回肠损伤。

3.3 疫苗免疫应答与效用

Guedes等[14]研究了猪致病性细胞分离株和商品活疫苗对猪的免疫应答的起始和持续时间、细胞介导和体液免疫反应。试验采用4.4×109致病性细胞分离物的PHE/MN1-00，胞内劳森菌致弱活疫苗株接种5周龄猪13周，每组各选1头于感染22 d后接受安乐死，以确认是否感染。接种致病分离株2周后首次检测到猪的体液免疫反应和细胞免疫反应；接种改良活疫苗组的猪分别检测到5周和4周的免疫反应。接种13周后，仍有部分猪出现体液反应和细胞免疫反应。粪便脱落最初检出时间为接种致病菌株1周后，持续时间为间歇性12周；接种活疫苗后2周，持续时间为间歇性9周。总之，受到致病菌株与活疫苗接种的猪均显示了长期的胞内劳森菌脱落和免疫反应。动物接种后1～4周的致病菌分离群中观察到的持续性腹泻与其他试验研究的结果一致。另外一项研究也证实了疫苗免疫组没有明显的持续性腹泻，并证实了疫苗的安全性[15]。

IFNγ是TH-1型T细胞介导的重要细胞因子，可由CD4+或CD8+T细胞等多种肠黏膜细胞分泌。趋化因子IL-8还能刺激吞噬细胞，促进血管生成，帮助受损黏膜修复。多种细胞因子通过对抗促炎细胞因子和维持肠上皮屏障的作用，在调节免疫稳态方面发挥着重要作用，但这些T细胞与细胞因子是如何影响胞内劳森菌的仍不清楚[16]。目前，在控制猪回肠炎方面仍然存在诸多挑战，但是我们可以期待在不久的将来动物疾病防治会找到新方向，使养殖业获得新发展。