VIGS技术鉴定木薯糖转运蛋白Mesweet18的功能研究

薛晶晶，安飞飞，罗秀芹，蔡杰

中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，农业农村部木薯种质资源保护与利用重点实验室，海口 571131

病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技术是一种RNA介导的植物天然抗病毒技术，主要利用遗传免疫操作系统性沉默某一特定基因，再经过表型鉴定和基因表达确定靶基因在植物生长发育中的作用及对环境变化产生的应激响应［1］。VLGS技术能够利用携带靶基因片段的病毒侵染植物，激活植物免疫系统，使其体内与靶基因同源的RNA被特异性降解，从而发生基因沉默［2］。VIGS技术操作简单，实验周期短，对实验室的设备要求低且无需进行植物组织培养，但只有遗传后代纯合后才能进行深入的基因功能分析。VIGS发生在RNA转录后，可以大大缩短对植物生长发育相关调控基因进行功能验证所需要的时间［3-4］。VIGS对于研究获得突变体较难的作物优势突出。通过VIGS可以阐明调控器官发育、次生代谢及植物对生物和非生物胁迫响应等许多基因的功能［5］。

木薯（Manihot esculentaCrantz）是热带、亚热带地区重要的粮食作物［6］。随着木薯产量的提升和研究技术创新，它不仅是重要的粮食作物，也可作为一种工业和生物燃料，在一些国家用于生产工业淀粉和乙醇［7］。木薯遗传转化技术已经较成熟［8-9］，它可以通过稳定的遗传转化用于RNA干扰和基因编辑验证基因功能［10-13］，但其遗传转化过程需要耗费较长的时间，并不适用于所有的木薯基因型［9］。因此，VIGS可作为一种方便快捷的方法应用于木薯基因功能的验证。Zhang等［14］通过VIGS验证了木薯4个MeLRR基因对Xam的抗性来正向调控木薯白叶枯病。Beyene等［15］发现MeAPL3是木薯贮藏根淀粉和干物质积累的关键亚型。He等［16］验证了异源三聚体NF-Y转录因子复合物能够正调控木薯对Xam的抗病性。

本研究基于木薯花叶病毒（Cassava common mosaic virus，CsCMV）的VIGS载体构建木薯糖转运蛋白Mesweet18的沉默载体pCsCMV-Mesweet18，注射木薯SC9的盆栽苗叶片；通过植株的表型观察、qRT-PCR分析、叶绿素含量及可溶性糖含量测定，研究Mesweet18在木薯中的分子功能，以期为进一步研究糖转运蛋白SWEET在木薯中的分子机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

实验品种为木薯SC9，生长于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家木薯种质资源圃。

1.2 方法

1.2.1 木薯Mesweet18沉默片段的获得利用SGN VIGS工具选择木薯Mesweet18基因沉默的靶基因区域［17］，序列片段长300 bp，根据靶基因序列设计引物（表1）。参照RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）的操作说明提取木薯SC9叶片总RNA，用DNAse I柱上消化RNA样品中残留的微量DNA。cDNA第一链的合成参照Thermo Scientific RevertAid RT试剂盒说明书进行。

表1 研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the study

1.2.2 木薯Mesweet18沉默载体的构建Mesweet18基因片段扩增回收后，采用Nimble Cloning试剂盒将目的片段和pCsCMV-NC载体进行连接，具体操作过程参照Tuo等［18］的方法和试剂盒说明书，连接产物采用热激转化大肠杆菌Top10感受态细胞。PCR筛选阳性单克隆进行测序验证，序测正确的载体即为VIGS所需的重组沉默载体pCsCMV-Mesweet18。

1.2.3 农杆菌注射将沉默载体pCsCMVMesweet18通过热激法转入农杆菌GV3101感受态细胞，在卡那霉素（50μg·mL-1）和利福平（25μg·mL-1）抗性条件下筛选转化子，PCR鉴定呈阳性的克隆菌液即为本试验所需的农杆菌单克隆。

得到VIGS所需的pCsCMV-Mesweet18重组载体农杆菌后，在带有抗性的YEB培养基中培养至OD600约为0.8～1.0，农杆菌注射方法参照Tuo等［18］进行。在生长20 d的木薯SC9盆栽苗叶片背面进行注射。为了验证VIGS沉默体系，设计如下试验：阴性对照组木薯注射pCsCMV-NC空载体，阳性对照组注射pCsCMV-CHLD载体；实验组注射pCsCMV-Mesweet18载体；空白对照组木薯不做任何处理。20 d后开始观察木薯新生叶片生长情况。

1.2.4 木薯Mesweet18沉默效果检测运用RTPCR技术检测空白对照组、阴性对照组、阳性对照组以及实验组目的基因的转化情况，得到的目的条带进行测序验证。qRT-PCR法检测测序正确的株系中Mesweet18的表达水平，木薯Actin基因作为内参，设置3个重复，用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.2.5 木薯Mesweet18沉默植株中叶绿素含量和可溶性糖含量的检测采用分光光度计法测定叶绿素含量，取0.1 gMesweet18沉默植株上第二片展开叶，将叶片剪成2 mm宽的碎条放入试管中，加入15 mL乙醇-丙酮混合液，避光放置24 h，期间晃动3～5次，等叶片变白后定容至25 mL。以混合液为空白对照，分别在波长663、645 nm下读取吸光值并计算叶绿素含量，设置3次重复，取均值进行统计分析［19］。计算公式如下：Cha=12.7D663-2.69D645；Chb=22.9D645-4.68D663；Cht=Cha+Chb=20.2D645+8.02D663。Cha、Chb分别为叶绿素a、b的含量；Cht为叶绿素总含量。采用试剂盒检测植物中淀粉、蔗糖、果糖和葡萄糖的含量，具体方法参照说明书（Solarbio公司）。

1.2.6 统计分析采用Excel进行数据分析和作图，使用GraphPad Prism5对实验结果进行Dunnett's检验（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 木薯Mesweet18沉默植株的获得

利用pCsCMV载体的通用引物对空白对照组、阴性对照组（pCsCMV-NC）、阳性对照组（pCsCMV-CHLD）以及实验组株系进行检测（图1），结果显示：空白对照无条带，阴性对照在1 000 bp处有条带，转化成功的植株在670 bp处有1条目的条带。对不同处理下木薯植株的表型观察发现（图2），木薯实验组Mesweet18沉默植株的新叶与空白对照组、阴性对照组差异明显，呈现明显的花叶。

图2 木薯Mesweet18沉默植株表型观察Fig.2 Phenotypic observation of cassava Mesweet18 silenced plants

2.2 Mesweet18在木薯沉默植株的表达分析

qRT-PCR检测pCsCMV-Mesweet18沉默植株表达水平的变化（图3），发现实验组-1，2，3沉默植株Mesweet18的表达量仅为对照的46.80%、30.23%、21.12%。这 一 结 果 表 明pCsCMVMesweet18可以高效沉默木薯Mesweet18基因的表达。

图3 木薯Mesweet18沉默植株的表达水平分析Fig.3 Expression level analysis of cassava Mesweet18 silenced plants

2.3 木薯Mesweet18沉默植株中叶绿素和可溶性糖含量的测定

沉默糖转运蛋白Mesweet18的表达可能影响木薯中糖的运输，从而影响叶片中叶绿素和可溶性糖的含量。测定实验组-1、2、3沉默后植株成熟叶片的叶绿素a、b及叶绿素总含量（图4），发现叶绿素a、b及叶绿素总含量与对照相比均出现不同程度的下降，其中叶绿素a的含量在实验组-1、2、3中分别下降了22.43%、10.91%、12.24%；叶绿素b的含量在实验组-1，2，3中分别下降了22.42%、10.03%、12.09%；叶绿素总含量在实验组-1、2、3中 分 别 下 降 了22.35%、10.68%、12.28%。对可溶性糖含量的分析发现（图4）：与空白对照组相比，实验组-1、2、3沉默后植株叶片的淀粉和葡萄糖含量无显著差异；实验组-1沉默的植株中蔗糖和果糖含量无显著差异，而实验组-2、3沉默后植株叶片的蔗糖和果糖含量显著上升，且果糖含量显著高于蔗糖。所有植株的葡萄糖含量均少于蔗糖和果糖，这表明木薯Mesweet18主要影响果糖的含量。

图4 木薯Mesweet18沉默植株叶片中叶绿素和可溶性糖含量分析Fig.4 Analysis of chlorophyll and soluble sugar content in cassava Mesweet18 silenced plants

3 讨论

应用VIGS技术能够有效沉默植物中的目标基因，不需要通过转基因株系和大量突变体鉴定，因而在研究与发育相关的基因上具有优势，是植物苗期基因功能鉴定的最佳手段［20］。通过VIGS技术沉默草莓的FaABI1和FaMYB5基因，发现其沉默效率均达到60%以上，前者沉默后导致果实提前成熟，后者导致果实中原花青素含量增加，在草莓中起负调控作用［21-22］。本研究采用了基于CsCMV的VIGS载体，在木薯中沉默效果较好，适用于对CsCMV敏感的木薯品系［18］。在木薯SC9中沉默表达糖转运蛋白Mesweet18后，发现沉默植株中Mesweet18的表达分别下降了53.2%、69.8%、78.9%，这表明Mesweet18在SC9中的表达受到抑制，CsCMV-VIGS系统能够成功沉默SC9中Mesweet18的表达。

糖转运蛋白SWEET主要作用于质外体装载途径，能够将光合作用合成的蔗糖由韧皮部薄壁细胞卸出到质外体空间。酵母功能互补实验表明，Mesweet18在木薯中主要转运果糖。VIGS系统沉默Mesweet18后，叶片果糖含量显著高于蔗糖和葡萄糖，且pCsCMV-Mesweet18-2、3沉默后植株中果糖和蔗糖的含量呈上升趋势；而与对照相比，pCsCMV-Mesweet18-1沉默后植株叶片的蔗糖、葡萄糖和果糖含量没有显著差异，这可能是在基因沉默和糖检测实验过程中造成的沉默植株的淀粉和葡萄糖含量无显著变化。抑制木薯SC9中Mesweet18的表达，能够影响成熟叶片可溶性糖的 积 累。Ho等［23］利 用VIGS技 术 沉 默 番 茄 中SlSWEET1a基因，发现成熟叶片中己糖含量增加了2倍多，表明SLSWEET1a在番茄成熟叶片合成糖分向幼叶转运的过程中起着关键作用。这一结果与木薯SC9中Mesweet18沉默后叶片的糖含量变 化 趋 势 一 致。Schachtsiek等［24］通 过CLCrVVIGS系统成功沉默了大麻中的ChlI和PDS基因，发现大麻叶绿素a和类胡萝卜素含量均降低，这与本研究中沉默Mesweet18的表达可以下调叶片中叶绿素a、b和总含量的结果相类似。

基于CsCMV的VIGS载体用于木薯沉默基因表达，获得的植株表型可以维持4～6个月［18］。通过VIGS技术沉默木薯中Mesweet18的表达，将沉默植株移栽大田4个月后收获叶片和块根，研究幼嫩叶片、成熟叶片以及块根中的淀粉和糖含量变化趋势，明确了糖转运蛋白Mesweet18在木薯中的功能，本研究获得的结果可以为木薯糖转运蛋白SWEET的分子机理研究奠定基础。