植物营养元素胁迫相关microRNA研究进展

曹丹，马林龙，刘艳丽，王丽丽，金孝芳*

1.湖北省农业科学院果树茶叶研究所，武汉 430064；

2.福建省农业科学院茶叶研究所，福州 355000

MicroRNA（miRNA）是一类长度约为20 nt的单链RNA，主要通过诱导靶基因mRNA降解或抑制其翻译起负调控作用。1993年，Lee等［1］首次在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）体内发现了第一个miRNA基因（lin-4）。随着生物技术手段的不断进步，越来越多的miRNA及其靶基因被挖掘出来。MiRNA获得的方法主要有正向遗传筛查、生物信息学分析、直接克隆、表达序列标签（expressed sequences tag，EST）分析和高通量测序等［2-3］。根据Sanger miRBase 22.0的最新数据，目前在271个物种中共有48 885条成熟miRNA和38 589条miRNA前体序列，且数据仍然在不断更新和完善中。已知miRNA广泛存在于植物、动物和线虫等生物体中，参与许多生物学过程，主要包括生长发育、代谢、蛋白降解、信号转导和逆境胁迫等［4-6］。

营养元素在植物生命活动中具有重要的功能，越来越多的研究发现miRNA在植物响应营养元素胁迫中发挥着至关重要的作用（表1）。

表1 植物响应营养元素胁迫的miRNAsTable 1 MiRNAs responding to nutrient stress in plants

1 MiRNA参与低磷胁迫

土壤中的磷易被铁、钙、铝等元素固定，降低其迁移率，引发有效磷缺乏，而土壤中缺乏有效磷已成为限制农业发展的重要因素之一［7］。MiR399e和miR399g在调节大豆磷平衡中发挥了重要作用。高磷高氮条件下，OE-miR399e-6和OE-miR399e-7转基因大豆老叶的可溶性磷含量分别是野生型的2.31倍和2.37倍；同时在OE-miR399g-1转基因株系中，相比于高磷高氮，高磷低氮更有利于可溶性磷在老叶中积累。另外，过表达OE-miR399g-1大豆株系的总磷含量在3个磷氮处理下（高磷高氮、低磷低氮、高磷低氮）均高于野生型［8］。Du等［9］发现miR399在玉米缺乏磷元素时高表达，miR399b转基因玉米芽中积累了大量的磷元素，表现出典型的磷中毒性状。进一步研究发现，磷缺乏诱导的长非编码RNA1（PILNCR1）与miR399互作对玉米的低磷耐受性具有重要作用。刘浩等［10］发现在低磷胁迫下，miR399f、35S：MIM156、35S：MIM156miR399f转基因植株中的无机磷含量均高于野生型，推测miR399和miR156共同参与调控磷元素平衡。miR827的靶基因是NLA（nitrogen limitation adaptation），NLA可与磷酸转运蛋白基因在细胞膜上互作，从而调节植物磷平衡［11］。在烟草中发现，缺磷可诱导miR827差异性表达，靶基因NsSPXMFS1和NsSPX-MFS2分别下调和上调，酵母试验结合亚细胞定位结果推测，miRNA827及其靶基因可能通过介导细胞质和液泡中磷的转运实现对植株的磷调控［12］。

此外，缺磷还可诱导拟南芥中的miR778表达上调、miR398表达下调［13］，大豆中的miRNA894、miR159、miR1509、miR1507等上调，以及miR398、miR165、miR166、miR1511、miR1450等 下 调［14］。吕春雨等［15］将大豆miR168转入烟草中发现，过表达miR168能增强烟草对低磷胁迫的耐受性，同时可能参与调控ABA和JA介导的种子萌发信号。

2 MiRNA参与硫胁迫

近年来，由于无硫低硫化肥的广泛施用、工业含硫废气排放的控制以及集约化农业的实施，土壤含硫量逐渐降低，土壤缺硫的问题也随之凸显出来［16］。李利红等［17］利用高通量测序技术发现30 mg·m-3SO2处 理 拟 南 芥72 h后，186个 保 守miRNA和16个新miRNA发生差异表达，其靶基因主要涉及信号转导、刺激响应、代谢及转录调控等过程。其中miR393和miR160通过生长素信号途径调控植株的生长发育，参与植物响应SO2胁迫。miR395靶向硫酸转运基因（Sultr2；1）和ATP硫化酶基因（APS1、APS3和APS4），缺硫促进乙酰丝氨酸的累积，进而诱导miR395表达上调；向植株施用半胱氨酸后，植株的硫酸盐吸收和同化被抑制，同时提高miR395的水平，而谷胱甘肽合成抑制剂丁硫氨酸亚砜胺可抑制miR395的表达，因此，该研究认为miR395是硫酸盐合成调节网络的组成部分［18-20］。此外，还有研究认为，乙烯转录因子SLIM1（sulfur limitation1）在一定条件下有助于miR395的累积，同时APS3和Sultr2；1表达上调，而APS1和APS4表达下调［21］。

3 MiRNA参与氮胁迫

氮是蛋白质、叶绿素、核酸及代谢产物的重要组成部分，植物的种子休眠、叶片发育、根部构型及开发等过程均受氮素影响［22］。在拟南芥中发现缺氮条件下，miR160通过调控ARF16和ARF17的表达诱导侧根生长，miR167可能通过解除对靶基因生长素转录因子的抑制促进侧根生长，miR171可以通过调节SCL6抑制初生根的伸长生长；进一步的试验发现，该胁迫下根系统实际由miR160、miR167和miR171组成的复合体调控，通过诱导miR171和miR160的表达、抑制miR167的表达来促进根的生长［23］。此外，茶树中的miR156可能通过靶向谷氨酸受体基因GLK和丙酮酸激酶基因PK参与调控氮缺乏时的茶氨酸代谢［24］。赵勐等［25］发现缺氮条件下，miR169a在拟南芥根和地上部表达下调，其靶基因NFYA5过表达植株的生物量明显高于野生型，推测miR169a通过调控NFYA5参与植物应对氮胁迫，同时转基因植株根部与地上部的总氮含量均低于野生型，硝酸盐转运蛋白基因AtNRT1；1和AtNRT1；2的表达水平均低于野生型，说明miR169a在植物应对氮素含量变化过程中发挥着重要的调控作用。缺氮条件下，拟南芥miR5090和miR826过表达植株均显示出较强的耐受性，生物量和氮含量增加，长出更多的侧根和初生根等，同时AtNRT2；1和AtNRT1；5表达量增加，说明氮的吸收能力增强［26］。谢文召等［27］研究发现小麦miR1129对氮素呈典型的浓度及时间依赖性，低氮条件下miR1129超表达植株较野生型形态增大、干重增多及氮含量增加，推测miR1129在植物抵御低氮胁迫中起着非常重要的作用。低氮处理时，miR393a在光皮桦根和叶中的表达先下调后上调，在恢复组中均上调表达；而在茎中，低氮处理4 d后miR393a明显上调，恢复组中明显下调，表明miR393及其靶基因在低氮胁迫响应中发挥着调控作用［28］。孙青等［29］在玉米中发现，miR528在低氮处理时表达下调，其靶基因ZmLAC3和ZmLAC5表达上调，而在高氮处理时miR528表达上调；转基因试验发现，高氮下ZmmiR528可能通过调控其靶基因的表达，影响木质素的合成，从而调节玉米的倒伏性。此外，miR397靶向一个含有Cu2+的多酚氧化还原酶基因，在豆科植物百脉根结瘤时被诱导表达，参与共生固氮［30］。

4 MiRNA参与低钾胁迫

在番茄中采用sRNA高通量测序发现，miR156d-5p、miR168a、miR319a、miR319b、miR319c、miR477-3p及miR9472-3p7个miRNAs均可响应低钾胁迫［31］，miR171b、miR167g-5p、miR167b、miR168a在番茄根系中表达差异显著［32］。叶芝兰等［33］利用小RNA和降解组在西藏野生大麦XZ153和栽培品种浙大9号中鉴定到65个响应低钾胁迫的候选差异miRNA。其中miR164c、miR169h、miR395a及其靶基因参与了三羧酸循环、糖酵解和磷酸戊糖途径，miR166g和miR482参与植物钙信号调节，miR171e和miR396c参与调控乙烯生物合成过程中的蛋氨酸补偿途径，这些差异表达miRNA在耐低钾品种响应低钾胁迫过程中发挥着重要作用。李倩等［34］研究发现，低钾处理下的花生根系中有20个miRNA及其靶基因发生差异表达，其中miR160表达差异倍数最高。

5 MiRNA与其他营养元素

利用组学技术分析发现，柑橘在缺铁情况下，叶片中有50个miRNA表达上调，31个表达下调［35］。进一步研究发现，miR397、miR172、miR408、miR319、miR477和miR398可能在柑橘应对缺铁过程中起着至关重要的作用；在缺硼条件下，miR397及其靶基因LAC7均发生差异性表达，推测miR397通过负调控其靶基因LAC7提高漆酶活性和增加木质素的累积以应对硼胁迫。卢艺彬等［36］利用Illumina测序发现，缺硼条件下，雪柑根系中分别有52个差异表达miRNA上调和82个miRNA表达下调，miRNA主要通过激活防御系统、增加侧根、改善渗透调节等方面来调控根系对缺硼的适应性；此外，在叶片中获得了91个上调和81个下调差异表达miRNA，叶片miRNA对缺硼适应性主要表现在削弱生长发育、稳定叶片表型、减少硼运出以及提高超氧化物歧化酶活性等。

高铝胁迫8 h后，日本晴根系中有13个表达下调的miRNA和6个表达上调的miRNA，而在“Embrapa Taim”品种中有5个下调和3个上调表达的miRNA，结合靶基因分析推测这些miRNA通过调控多种代谢途径来参与水稻对高铝胁迫的抗性［37］。Chen等［38］利用高通量测序技术发现蒺藜苜蓿在遭受铝毒害过程中，有23个miRNA发生响应，大多数响应基因表达下调，将这些miRNA分成迅速响应、延迟响应和持续性响应三种类型，其中大部分属于迅速响应型。谭国胜等［39］在耐铝大豆中鉴定到9个miRNA响应铝胁迫时表达下调，推测它们与大豆的抗铝胁迫相关。相比于抗氧化胁迫相关的miR169r，调控大豆根伸长的miR166k/o、miR390g和miR396c/k在抗铝胁迫过程中发挥了更重要的作用［40］。

薛泽云等［41］利用高通量测序技术在凤丹中发现12个保守miRNA和18个新miRNA响应铜胁迫差异性表达。杜秋霞等［42］在铜胁迫下的桑叶组织中鉴定到40个miRNA差异表达，其中27个上调表达和13个下调表达。杨惠荔等［43］研究发现，小麦在铜胁迫下添加外源硅，分别有miRNA156、miRNA396、miRNA894等58个miRNA表达上调，miRNA159、miRNA393、miRNA160等41个miRNA表达下调；铜胁迫下添加外源一氧化氮，分别有miRNA482、miRNA531、miRNA894等26个miRNA表达上调，miRNA159、miRNA166、miRNA396等66个miRNA表达下调。

6 展望

随着高通量测序技术的发展，越来越多的营养胁迫相关miRNA被挖掘出来，但其功能和调控机制的研究依然很少。一个miRNA可以响应多种营养元素胁迫，一种营养元素胁迫也存在多个miRNA响应，这形成了复杂的调控网络。如miR160同时响应S、N、K、B、Al、Cu等元素胁迫，P、S、N等元素胁迫中均有多个miRNA发生响应，但它们之间是如何相互作用的，有待于进一步深入开展研究。此外，对K、Fe、B、Al、Cu等元素而言，虽然鉴定到许多差异表达基因，但大多数研究仅停留在基因表达层面，哪些是关键调控基因以及调控机理尚不明确。因此，加大对营养元素胁迫相关miRNA的研究力度，对选育植物耐性品种和提高植物对营养元素胁迫的适应能力都具有重要的作用。