副溶血弧菌CHY5-M1M噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析

刘力萍，王宏华，王峰，丁鹏，孙子豪，王哲，乔颖，侯竹美*

1.青岛农业大学海洋科学与工程学院，山东 青岛 266109；

2.潍坊华卓生物科技有限公司，山东 潍坊 261100

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）属于弧菌科弧菌属。据调查，我国沿海水域及海产品中副溶血性弧菌的检出率较高，尤其是气温较高的夏秋季节［1］。副溶血弧菌可引发大规模水产养殖业病害，造成海水鱼类体表发炎充血和南美白对虾发生急性肝胰腺坏死综合症［2］。同时，作为人畜共患病菌，人类食用携带副溶血弧菌的食物后，会导致人体发生急性胃肠炎，少数情况引发败血病，甚至危及生命［3］。

噬菌体（becteriophage）是细菌的制衡者，具有特异性、裂解性和天然性等特点。鉴于细菌的自我防御，噬菌体也在不断进化中。近年来，我国倡导绿色水产养殖，发布了关于抗生素禁用的政策，明确表示对滥用药物的行为进行严惩［4］。目前，国内外研究的关注点集中于噬菌体对水产品中致病菌的作用效果，它作为生物抗菌剂［5］在养殖业中对水产品病原菌控制方面的成效显著。

本研究从青岛市城阳市水产批发市场采集的15份海产品养殖水及下水道污水中分离获得一株副溶血弧菌噬菌体CHY5-M1M，并对其基本的生物学特征和应用进行研究，以期为筛选出裂解性强的噬菌体和设计新型药物提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 宿主菌副溶血弧菌（编号：186296）样品，分离自青岛市城阳水产品批发市场养殖水和下水道污水。

1.1.2 主要试剂和仪器营养琼脂（nutrient agar，NA）购自青岛科技工业园海博生物技术有限公司；酵母粉购自兰杰柯科技有限公司；琼脂粉购自生物工程股份有限公司；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000购自国药集团化学试剂有限公司；SM缓冲液购自北京雷根生物技术有限公司；DNA试剂盒购于杭州西顿生物科技有限公司；智能恒温培养振荡器购自天津欧诺仪器股份有限公司；全温振荡器购自苏州市培英实验设备有限公司；高速冷冻离心机购自热电实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体的分离采用点滴法分离采集样品中的副溶血弧菌噬菌体。采集水样以5 000 r·min-1离心10 min后取上清液过滤。取对数期的副溶血弧菌0.1 mL与0.1 mL滤液于5 mL LB液体培养液中，混合均匀后放入37℃摇床。增殖后离心10 min，0.22μm过滤膜过滤上清。移取0.1 mL上清加入含0.75%半固琼脂中混匀，倒入底层有NA的平板，放入37℃培养8 h，观察是否有噬菌斑［6］。

1.2.2 噬菌体的纯化及效价测定采用双层平板法纯化噬菌体［7］。移取噬菌体原液和副溶血弧菌混于试管中，37℃孵育20 min，混于半固体培养基中，倒双层平板。培养8 h后观察结果。用无菌枪头挑取噬菌斑放入1 mL SM缓冲液中。37℃摇床培养40 min，将浸出液离心过滤。然后进行10倍比稀释，继续双层平板法培养。以上操作重复3次，直至出现大小相同、独立、分布均匀的噬菌体斑。纯化的噬菌体增殖后双层平板法测定噬菌体增殖液效价。

1.2.3 噬菌体最佳感染复数测定将菌液按10倍比稀释后分别平板涂布，培养8 h后计算菌落数量。根据细菌效价，分别按噬菌体效价/对数期宿主菌浓度（MOI）=100∶1,10∶1,1∶1,1∶10,1∶100,1∶1 000混合后，再与5 mL LB液体培养基混合，震荡培养后离心过滤，此时会产生不同的噬菌体增殖液，采用双层平板法测得效价［8］。

1.2.4 噬菌体一步生长曲线测定取菌液与最佳感染复数的噬菌体混合于离心管中，放入37℃培养箱中孵育。取出混合液离心倒上清液。SM缓冲液重悬沉淀，洗涤重复2次。放入37℃、200 r·min-1摇床，此时记为0时刻，此后每隔20 min取一次样并离心，双层平板法测效价。根据横坐标感染时间、纵坐标噬菌体效价，绘制一步生长曲线［9］。

1.2.5 噬菌体热稳定性测定噬菌体培养液离心过滤，取1 mL分装到1.5 mL离心管中。将装有噬菌体的1.5 mL离心管分别放入30、40、50、60、70℃的水浴锅中温浴2 h，对处理好的噬菌体稀释测效价［10］。设置3个平行组。

1.2.6 噬菌体pH稳定性测定将0.1 mL噬菌体增殖液分别加入0.9 mL pH为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0的LB液体培养基中，放入37℃培养箱培养1 h后取样，用盐酸和氢氧化钠溶液分别将pH调至原培养基pH后，进行10倍比稀释，用双层平板法测定噬菌体效价［11］。

1.2.7 噬菌体的紫外线稳定性测定噬菌体增殖液放在无菌平皿中，打开盖子，使噬菌体液暴露在距离紫外灯35 cm处，连续照射60 min，每10 min取0.8 mL噬菌体液，进行10倍比稀释，利用双层平板法测定噬菌体效价［12］。

1.2.8 噬菌体的全基因组测序副溶血弧菌噬菌体原液10 mL，加入0.584 g氯化钠、1.0 g PEG 6000，室温溶解混合后冰浴3 h，4℃10 000 r·min-1离心10 min，弃上清，沉淀加0.2 mL PBS重悬，获得基础噬菌体浓缩液。再加入0.015 mL DNase，混匀放入37℃水浴30 min，除去宿主DNA。之后加0.05 mL RNase，混匀后放入37℃水浴15 min，除去宿主RNA。将处理样品储存于-20℃备用。

委托上海凌恩生物科技有限公司利用Illumina novaseq 6000测序平台对基因组进行测序［13］。首先，过滤低质量测序数据，获得高质量的清除数据（clean data）；其次，利用组装软件对清除数据（clean data）进行组装，多次调整参数及补洞后获得基因组序列，之后对编码基因（coding gene）进行分析；最后将基因功能与通用功能数据库比对，注释编码基因［14］。

2 结果与分析

2.1 噬菌体的分离纯化及噬菌斑形态特征

从青岛市城阳水产品批发市场采集的海产品养殖水及下水道污水，采用点滴法分离纯化副溶血弧菌噬菌体，获得12株噬菌体。通过双层平板法测效价发现CHY5-M1M效价最高，为8.65×1013PFU·mL-1（表1）。

表1 噬菌体名称及其效价Table 1 Phage names and their potencies

由于噬菌体CHY5-M1M具有最高效价、较好的生存活力、易于快速培养且在有污染的水体中存在较多，所以整体实验以该噬菌体为主要对象开展后续生物学特性分析。

通过点滴法分离出以副溶血弧菌为宿主菌的噬菌体CHY5-M1M，双层平板法纯化的噬菌斑大小均匀一致、圆形、边缘有晕环（图1）。

图1 双层平板法纯化噬菌体Fig.1 Purification of phage by double layer plate method

2.2 噬菌体CHY5-M1M的最佳感染复数

双层平板法分析可知（表2），CHY5-M1M的最佳感染复数为1∶1 000，此时最佳感染效价为1.05×1022PFU·mL-1，这表明该噬菌体可在副溶血弧菌中实现复制和扩增，感染能力强。

表2 噬菌体CHY5-M1M最佳感染复数Table 2 Optimal infection complexes of phage CHY5-M1M

2.3 噬菌体CHY5-M1M的一步生长曲线

由图2可知，CHY5-M1M感染宿主菌20 min内，噬菌体数量稳定，而噬菌体裂解期是40～140 min之间，之后进入平稳期，噬菌体数量重新保持稳定。由此得出，该噬菌体潜伏期20 min，并根据裂解量标明得到CHY5-M1M噬菌体裂解量为1.98×107PFU·cell-1，对 副 溶 血 弧 菌 裂 解 性较强。

图2 噬菌体CHY5-M1M一步生长曲线Fig.2 One-step growth curve of phage CHY5-M1M

2.4 噬菌体CHY5-M1M的热稳定性

由图3看出，噬菌体在40℃时与未处理时的活性最接近；30℃和50℃时，噬菌体效价有所下降；在50℃之后，噬菌体存活率大大降低，60℃、70℃噬菌体基本失活，之后检测不到噬菌体存在。由此可见，该噬菌体对40℃的温度具有较好的稳定性，同时它的感染能力很容易在不适条件下失活，热稳定性较差。

图3 噬菌体CHY5-M1M的热稳定性Fig.3 Thermal stability of phage CHY5-M1M

2.5 噬菌体CHY5-M1M的pH稳定性

噬菌体CHY5-M1M在pH 5～10范围内的效价保持在108PFU·mL-1左右，具有稳定性和良好的裂解活性。高于或低于最适pH范围都会引起噬菌体活力的改变，当pH≤3或者≥12时，基本检测不到噬菌体的存在（图4）。由此可以看出，噬菌体CHY5-M1M存活率有较宽的pH范围。

图4 噬菌体CHY5-M1M的pH稳定性Fig.4 pH stability of phage CHY5-M1M

2.6 噬菌体CHY5-M1M的紫外线稳定性

有图5可知，在距紫外灯光源35 cm处连续照射30 min时，噬菌体CHY5-M1M效价明显下降；而连续照射40 min后，噬菌体CHY5-M1M效价下降约5个数量级。这一结果表明，噬菌体CHY5-M1M对紫外照射耐受性差。

图5 噬菌体CHY5-M1M的紫外稳定性Fig.5 UV stability of phage CHY5-M1M

2.7 噬菌体CHY5-M1M的全基因组分析

采用R circlize包进行基因组圈图的绘制（图6）。噬菌体CHY5-M1M全基因组长43 193 bp，其中A、C、G、T碱基含量分别为21.27%、20.71%、28.56%、29.46%，其中G+C含量为49.37%。全基因组中未发现毒力因子基因和抗生素耐药基因。

图6 噬菌体CHY5-M1M的基因组圈Fig.6 Genome circle of phage CHY5-M1M

用NCBI网站BLASTn程序进行噬菌体CHY5-M1M基因序列比对，在所有得到的同源序列中，噬菌体CHY5-M1M与弧菌噬菌体vB_VpaP_KF1（NC_048035.1）和弧菌噬菌体vB_VpaP_KF2（NC_048036.1）的一致性分别为98%和97%，且两者在分类上均属于斑疹病毒。

根据噬菌体全基因组，使用BLASTp对蛋白质序列进行分析，发现有44个开放阅读框（open reading frames，ORFs），44个ORF中起始密码均为ATG。这些序列主要为结构蛋白基因、核酸代谢和一些未知蛋白。其中ORF5（主要衣壳蛋白）、ORF6（支架蛋白）以及ORF7（头尾连接蛋白）在组成噬菌体过程中起重要作用。此外，ORF10（RNA聚合酶）、ORF13和ORF15（编码外切酶）、ORF23（DNA聚合酶）、ORF25（DNA解旋酶）、ORF26（引发酶）、ORF39和ORF40（编码成熟酶）参与噬菌体DNA复制和调控相关基因过程。

3 讨论

本实验采集的噬菌体主要来自水产品批发市场下水道污水，其中下水道污水是细菌繁殖的聚集地，更易产生噬菌体［15］。然而在养殖水体中未发现噬菌体，可能的原因是养殖过程中药物使用以及监管力度加强［16］。通过双层平板法得到的烈性噬菌体命名为CHY5-M1M，证明了分离纯化方法的适用性。

噬菌体CHY5-M1M的热稳定性、pH稳定性和紫外线稳定性等生物学特性与已报道的副溶血弧菌噬菌体相近，说明该噬菌体具有有效性。噬菌体CHY5-M1M耐高温能力强，60℃处理30 min后存活率仍然达到75.8%。邱德全等［17］采用60℃处理分离的噬菌体20 min，仅有64.9%的存活率。噬菌体CHY5-M1M在pH 12时存活率仅10%，而丁云娟等［18］分离的副溶血弧菌噬菌体测定结果显示pH为12时仍有75.3%存活率。这说明噬菌体CHY-M1M耐碱性较差。

基因组分析是噬菌体分类的重要依据，本实验利用Illumina novaseq 6000测序平台对噬菌体CHY5-M1M进行了全基因组测序，利用BLASTp进行分析，结果发现该噬菌体中有10个ORFs找到了相似序列，表明该噬菌体仍有待进一步深入研究［19］。已报道的噬菌体基因组以大于5 kb为主，如吴春光等［20］测得的噬菌体基因组为83 428 bp。噬菌体CHY5-M1M基因组小于5 kb，在侵染宿主菌时会更加迅速。本研究发现噬菌体CHY5-M1M与NCBI数据库中的弧菌噬菌体vB_VpaP_KF1和弧菌噬菌体vB_VpaP_KF2一致性最高，为97.5%。此外，基因组功能预测显示噬菌体CHY5-M1M不含毒力因子和抗性因子，说明该噬菌体安全性高。

本研究为开发治疗副溶血弧菌的噬菌体药剂提供了理论基础和噬菌体储备。但噬菌体的抗菌性、安全性以及CRISPR/Cas的细菌防御系统仍是巨大挑战［21］，这需要研究者和管理者共同努力［22-23］，研发更加有效的治疗方法［24-25］，评估消费者对噬菌体治疗的认识和接受程度并制定相应的法律法规。