孕期地塞米松暴露对大鼠子代海马神经元增殖以及突触可塑性的影响

秦佳鑫，姚宝珍

武汉大学人民医院儿科，武汉 430060

胎儿发育过程中，神经系统会受到宫内环境的影响，不良环境暴露可导致子代海马形态结构异常以及发育、学习记忆改变。已有研究证明，暴露于糖皮质激素、抗炎、抗癫痫、抗精神病等多种药物［1-2］均可通过减少海马神经增殖分化以及增加海马神经元凋亡的机制使海马神经元数量减少、密度降低以及海马的突触可塑性［3］改变。

地塞米松是一种糖皮质激素药物，具有抗炎、抑制免疫、抗休克及增强应激反应等药理作用，广泛应用于治疗多种疾病，如自身免疫性疾病、过敏、炎症、哮喘及皮肤病等。临床上常使用地塞米松来促进早产儿的肺成熟以及孕期预防胎儿呼吸窘迫综合征，是目前较为公认的孕期安全用药。前期实验表明，孕期地塞米松暴露（prenatal dexamethasone exposure，PDE）可导致大鼠子代空间记忆以及学习缺陷［4］。在PDE的恒河猴模型中，海马CA区锥体神经元和齿状回颗粒神经元数量减少以及苔藓纤维的轴突突触末端显示出明显的变性现象［5］。此外，孕期暴露于地塞米松会导致子代癫痫、抑郁症等神经系统疾病发病率增高［6-7］。因此，我们提出PDE可能导致子代海马发育不良。

在大脑的正常运作过程中，正常的神经功能取决于神经元连接的精确模式，而这又取决于成熟大脑中存在的数万亿个突触［8］。为了满足动物在不断变化的环境中的生存要求，无论是结果还是功能上，突触都不是一成不变的，而是会经历持续的变化，这被称为突触的可塑性［9］。多种神经系统疾病，如自闭症、抑郁症、阿尔兹海默症等［10-13，15，17］，均与突触数量以及突触可塑性改变有关。此前有研究证明APPL1（adaptor protein containing pH domain，PTB domain and leucine zipper motif 1）可充当连接神经元活动与基因转录的连接器，该途径有助于突触可塑性的修饰，故其对突触可塑性有不容忽视的作用［14-15］。本文探究了PDE导致子代海马突触可塑性受损是否与APPL1的改变相关，提出PDE可能通过调控APPL1的表达从而影响子代海马突触可塑性的损伤。

1 材料与方法

1.1 动物与处理

动物实验在武汉大学动物实验中心进行，该中心已获得国际实验动物护理评估与认证协会（AAALAC International）的认可。所有动物实验程序均在中国动物福利委员会批准的基础上进行。

建立地塞米松暴露大鼠模型，适应性喂养Wistar大鼠一周后进行繁殖和交配。于合笼后次日进行阴道检查，确认妊娠当日记为GD0。将妊娠大鼠随机分为对照组和PDE组。从妊娠第9天至妊娠第20天，两组大鼠分别皮下注射地塞米松0.2 mg·kg-1·d-1和等量的0.9%氯化钠溶液。在GD20当天，将孕鼠用异氟醚麻醉，然后处死。每组胎仔数在8～14只的怀孕大鼠标记为合格，取出胎鼠。每组随机取5个全脑，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片。从同窝中收集的剩余胎儿海马样本被汇集在一起，立即在液氮中冷冻后保存在-80℃，以作进一步分析。

1.2 材料

1.2.1 试剂PSD95（A6194）、GAPDH（AC002）的抗体均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；总RNA提取剂Trizol购于美国Invitrogen公司；4%多聚甲醛固定购于北京艾斯本技术有限公司；异氟醚购于美国Baxter Healthcare有限公司；逆转录和定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）试剂盒购自TaKa-Ra生物技术有限公司；所有引物均由天一汇源生物科技有限公司合成。

1.2.2 设备分光光度计和ABI Step One RT-PCR热循环仪购于美国赛默飞世尔科技公司；光学显微镜购于北京生物科技公司；石蜡组织切片机购于湖南荣和科技公司；高速离心机购于上海佳德仪器公司；净化工作台购于苏洁医疗器械（苏州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 总RNA提取、逆转录和RT-qPCR根据制造商的说明书提取总RNA。用分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，调整RNA浓度为1μg·μL-1。使用2μg总RNA制备单链cDNA（引物见表1）。RT-qPCR在10μL反应混合物中进行。为了更精确地量化基因转录本，将管家基因GAPDH的mRNA水平作为定量对照。相对扩增子表达量采用2-ΔΔCt法计算。

表1 qRT-PCR中引物序列及反应条件Table 1 Primer sequences and reaction conditions used in quantitative real-time PCR

1.3.2 蛋白质提取和蛋白质印迹分析从海马组织中提取蛋白质样品。使用BCA测定法测定蛋白质浓度。经过上样、电泳，转膜后用5%脱脂奶粉封闭1 h，再将膜与一抗在4℃下孵育过夜。用TBST洗涤3次后，加入抗小鼠GAPDH（1：5 000）二抗孵育。最后，使用ECL Plus试剂盒可视化蛋白质条带，平均光密度代表蛋白质的相对水平。

1.3.3 透射电镜观察突触超微结构每组分别随机选取雌、雄各3只胎鼠，断头，在冰上快速分离海马，切取1 mm3海马CAl区组织块，使用2.5%戊二醛溶液4℃固定24 h，按常规制作电镜标本，使用透射电镜观察海马CA1区超微结构改变。

1.3.4 统计与分析采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 8.0对实验数据进行分析。所有数据均采用平均值±标准差表示。独立样本t检验比较对照组和PAE组的平均值。多组比较采用单因素方差分析检验，然后采用dunnett-t检验确定两组之间的显著差异。P＜0.05被认为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 PDE对雌雄子代海马神经增殖的影响

增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。Ki67是增殖细胞的相关抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中是不可缺少的。与对照组相比，PDE子代海马雌雄性高剂量组PCNA、ki67均出现明显下调（P＜0.05，P＜0.01，图1）。提示PDE可致子代海马神经增殖减少。

图1 子代胎鼠海马增殖指标表达变化Fig.1 Changes of hippocampal apoptosis index in offspring fetal rats

2.2 PDE对雌雄子代海马神经凋亡的影响

Caspase-3是一种蛋白酶，其在细胞凋亡中起着不可替代的作用，是反映细胞凋亡的重要指标。RT-qPCR结果显示，与对照组相比，PDE雌雄子代Caspase-3均显著增加（P＜0.05，P＜0.01，图2）。提示PDE可致子代海马神经凋亡增加。

图2 子代胎鼠海马凋亡指标表达变化Fig.2 Changes of hippocampal apoptosis index in offspring fetal rats

2.3 PDE对雌雄子代海马突触可塑性的影响

突触融合蛋白（Syntaxin）、25 kD突触相关蛋白（SNAP25）在神经递质的释放和轴突生长过程中起着重要的作用，可作为突触的相关性指标。RT-qPCR结果显示PDE子代海马中Syntaxin以及SNAP25出现显著下调（P＜0.05，P＜0.01，图3）。Western-blot结果显示高剂量PDE子代海马中突触后致密蛋白95（PSD95）出现显著下调（P＜0.05，P＜0.01，图3）。提示PDE可致子代海马突触可塑性受损。

图3 子代胎鼠海马突触指标表达变化Fig.3 Changes of hippocampal synapse index in offspring fetal rats

2.4 PDE致雌雄子代海马突触可塑性受损

投射电镜结果显示（图4），对照组中突触结构完整，突触后致密带密度较高。地塞米松暴露组突出结构模糊，突触后致密带密度降低，PSD厚度显著减少，且突触间隙显著增宽。提示PDE可致子代海马突触可塑性受损。

图4 各组海马CA1区突触超微结构Fig.4 Ultrastructure of hippocampal CA1 area in each group

2.5 PDE通过调节APPL1介导子代海马突触可塑性受损

APPL1是含有多个结构域的衔接蛋白，有研究表明其定位于树突棘和突触，并调节海马神经元结构的发育。RT-qPCR结果显示PDE子代海马中APPL1转录水平显著下调（P＜0.05，P＜0.01，图5）。提示PDE可能通过调控海马中APPL1的表达从而影响子代海马突触可塑性。

图5 子代胎鼠海马APPL1 mRNA表达变化Fig.5 Change of hippocampal APPL1 mRNA expression in offspring fetal rats

3 讨论

地塞米松作为一种糖皮质激素药物，其在临床上应用广泛，妇产科常用于多种早产有关疾病的治疗。由于早产儿肺部多不成熟，可能会导致呼吸窘迫综合征的发生，降低了胎儿的生存率，故临床上多在孕晚期使用地塞米松来达到促进胎儿肺成熟的目的［16］。然而，近年来越来越多的研究表明，产前使用地塞米松会造成子代不良损伤［17-19］。目前临床地塞米松用药剂量标准常为0.05～0.2 mg·kg-1·d-1［20］，按照人和大鼠的剂量转换关系（人∶大鼠=1∶6.17）计算本研究中使用0.2 mg·kg-1·d-1地塞米松暴露量相当于0.03 mg·kg-1·d-1人群用药剂量。因此，本研究在实验中使用的地塞米松剂量是合理的，具有临床现实意义。

目前，关于神经系统疾病发病机制的假说已有较多研究，其中神经发生假说受到越来越多的关注和研究，该假说聚焦于海马齿状回神经发生减少。海马神经发生是指从神经干细胞增殖分裂成为定向神经祖细胞，并逐渐向功能区域迁移产生神经功能的完整过程。其中神经祖细胞的增殖活动是海马神经发生中的重要环节。研究发现，神经祖细胞增殖障碍会导致神经发生异常［21］。此外，神经祖细胞的增殖、分化及其功能在神经精神性疾病的发病机制和疾病治疗中极其重要，有研究发现在癫痫［22-23］、阿尔兹海默症、抑郁症等神经系统疾病中均有可能存在神经祖细胞发生减少现象；也有研究基于精神分裂症患者的神经祖细胞进行药物筛选以得到更为有效的治疗靶点［24］。突触是神经元信号传递的重要结构，神经突触可塑性被认为是神经回路发育以及记忆与学习功能的基础，其异常可导致多种神经疾病发生，例如癫痫、抑郁症和阿尔兹海默症等［25-27］。在本研究中，我们发现PDE可致子代胎鼠海马神经细胞发生减少，主要包括增殖减少以及凋亡增多两方面，进一步检测PDE子代海马突触相关发育指标发现，PDE会导致子代海马突触可塑性受损。

中枢神经系统的发育是一个复杂的过程，其在任何时间节点受到破坏都可能对大脑的结构和功能产生严重而持久的影响。在宫内，脑的发育受到基因和环境的双重影响［28-29］。由于孕期使用地塞米松的不完全安全性，本实验探究孕期地塞米松暴露与子代海马发育的关系，证实了孕期地塞米松暴露会导致子代海马神经发育损伤以及突触可塑性改变，未来实验中需要进一步对孕期地塞米松暴露是否导致子代神经系统疾病易感以及其可能的机制进行探究，这将对于临床地塞米松用药有一定借鉴意义。