CRISPR/Cas9全基因组筛选技术在疾病治疗中的应用及在眼科应用中的展望

周佳木，张贝贝，王艳歌，胡旭萌，葛可可，李盼，宋宗明

(郑州大学人民医院/河南省人民医院/河南省立眼科医院/河南省眼科研究所 眼科，河南 郑州 450003)

随着高通量测序技术及分子生物学的发展，基因编辑技术在疾病治疗中的应用不断增加，人们希望通过研究基因的功能、敲除致病基因或插入保护基因，达到治愈疾病的目的。因此，全面探索基因的功能成为时下热议的话题。簇状规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9，Cas9)全基因组筛选技术可直接作用于所有编码或非编码序列，快速筛选具有特定生物学功能的基因或DNA片段，主要用于研究各类疾病机制、药物开发、非编码序列功能及剖析基因功能关系[1]。

与其他器官或系统相比，眼球具有体积小、范围局限等生理结构优势，在使用腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)或慢病毒等载体时不会引起全身反应，中央角膜因没有血管而免疫赦免，这有利于维持基因编辑载体的活性，眼球在各种基因编辑的探索中具有得天独厚的优势。本文综述了全基因组筛选技术在疾病治疗研究中的应用进展及CRISPR/Cas9基因编辑技术在各类眼病中的广泛应用，对全基因组筛选技术未来在眼科的应用提出展望，同时剖析了这种方法存在的问题和未来发展方向，以期为眼科疾病基因编辑治疗的进一步应用提供参考。

1 CRISPR/Cas9系统及全基因组筛选的原理

CRISPR/Cas9系统是从细菌免疫系统中发现的一种高效灵活的基因组编辑工具，由一个单链向导RNA(single guide RNA，sgRNA)和一个具有核酸内切酶功能的Cas9蛋白组成。在sgRNA特异性识别下，Cas9蛋白到达基因组特定位点，对双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)进行切割[2]，产生双碱基键断裂(double strand breaks，DSB)。此后，dsDNA通过细胞自主性的非同源末端连接(nonhomologous end joining，NHEJ)或同源重组(homology directed repair，HDR)引入突变[3-4]。2013年，CRISPR/Cas9系统首次在真核生物DNA编辑及修饰中发挥作用[5]。另外，通过改造可使核酸内切酶失活形成失活cas9(nuclease-dead mutants of Cas9, dCas9)，dCas9不能对DNA进行切割，但保留了特异性结合能力，可将不同的功能结构域融合到dCas9蛋白上，使它们发挥更多功能，如单核苷酸编辑、调控转录和表观遗传学[6]。例如dCas9通过在转录起始部位融合或招募转录因子，形成CRISPR激活(CRISPR activation，CRISPRa)和 CRISPR抑制(CRISPR interference，CRISPRi)，可特定地激活或抑制转录。

通过设计和合成不同sgRNA靶向细胞的全基因组序列，在细胞群内高通量地靶向敲除目的基因，并置于特定环境中进行阴性或阳性筛选，利用二代测序识别影响细胞活性的功能基因。CRISPR/Cas9全基因组筛选的具体步骤包括设计构建sgRNA文库、慢病毒转染、环境筛选、测序及数据分析。2014年建立了包含18 080个基因及64 751个独特的引导序列的全基因组敲除文库(genome-scale CRISPR/Cas9 knockout，GeCKO)与GeCKOv2[7-8]，成为人们进行全基因组筛选的有利工具。

2 CRISPR/Cas9全基因组筛选在疾病研究中的应用进展

2.1 恶性肿瘤相关研究CRISPR/Cas9全基因组筛选技术在恶性肿瘤中的研究主要应用于以下方面。(1)筛查癌症相关因子，寻找潜在治疗靶点：肿瘤的发生往往与促癌基因的活化或抑癌基因的失活有关，相关的突变基因或调节因子是药物治疗的潜在靶点。如在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)研究中，通过对AML细胞系进行CRISPR/Cas9全基因组筛选，发现PAICS基因能够抑制AML细胞增殖，因此PAICS及其相关基因为AML治疗的潜在靶点[9]。(2)寻找癌症治疗中的合成致死靶点：基因突变的癌细胞在一些其他基因突变或抑制时发生死亡，通过筛选这些癌症基因突变的驱动因素，有利于进一步推动癌症基因靶点的发现，同时为治疗提供新途径[10]。(3)寻找免疫治疗的靶点：免疫细胞特异性基因缺失有助于更好地了解肿瘤微环境在肿瘤发生中的作用，促进肿瘤的免疫治疗。2020年，Li等[11]通过体内表观遗传学CRISPR筛查，确定了Asf1a是肺腺癌对抗PD-1治疗敏感性的关键调节因子，Asf1a被鉴定为Kras突变型肺腺癌的免疫治疗新靶点。

2.2 疾病耐药性研究随着药物的研发与广泛应用，耐药性的发生是许多疾病治疗过程中的“绊脚石”，CRISPR/Cas9全基因组筛选技术也被应用于相关研究中。(1)筛选疾病耐药相关的突变基因或调节因子，通过对比可发现耐药时细胞分子水平的改变。如在一定浓度鲁索利替尼的环境中对急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)进行全基因组CRISPR/Cas9筛查，发现CRKL的缺失增强了野生型细胞对鲁索利替尼的敏感性[12]。(2)寻找其他敏感靶点：一些治疗靶点的联合用药能够显著提高药物敏感性，减少耐药性的发生。Lan等[13]利用CRISPR/Cas9全基因组筛查确定胰腺癌放疗的敏感靶点，并通过开发放疗增敏剂，为克服胰腺癌对放射治疗的耐受性提供新的策略。(3)通过基因组转录水平调控：CRISPRa文库及CRISPRi文库在检测耐药基因方面同样发挥重要作用。Cai等[14]利用CRISPRa文库通过上调靶基因并诱导耐药，发现LRP8基因可以驱动HCC细胞获得索拉非尼耐药性。另外，Liu等[15]利用CRISPRi文库筛选发现lncGRS-1为加强胶质瘤放射治疗的特异性治疗靶点。

2.3 病毒感染相关研究病毒感染是指病毒通过多种途径侵入机体，并在易感的宿主细胞中增殖的过程，病毒可在体内持续多年，对特定的组织、器官或系统造成损害。CRISPR全基因组筛选技术主要应用于以下方面[16]。(1)研究病毒-宿主的相互作用：通过CRISPR/Cas9全基因组筛选可发现病毒感染过程中进入扩散[17]、复制[18]及病毒蛋白的稳定性[19]相关的宿主基因或宿主因子，能够靶向病毒感染过程，截断病毒与宿主的连接，为病毒感染的治疗奠定基础。研究发现TRIM26的缺失会特异性损害丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)基因组复制，从而确定了TRIM26是HCV复制的宿主因子，有助于HCV动物模型的建立[20]。(2)确定病毒感染的潜在治疗靶点：病毒感染具有潜伏期，可躲避细胞免疫，因此找到维持潜伏期的因素至关重要。Rathore等[21]通过在人类免疫缺陷病毒潜伏期细胞系模型中利用CRISPR/Cas9全基因组功能敲除进行筛查，发现人类免疫缺陷病毒潜伏期的潜在调节因子IWS1、POLE3、POLR1B、PSMD1和TGM2。(3)免疫学研究：一些免疫因子(如干扰素)能够抑制病毒的感染过程。如通过全基因组CRISPR筛查，研究者发现IFI6通过防止病毒诱导的内质网膜内陷的形成来预防性保护未感染的细胞，从而达到抗病毒的目的[22]。

3 CRISPR/Cas9基因编辑技术在眼科疾病研究中的应用进展及局限性

3.1 Leber先天性黑矇(Leber’s congenital amaurosis，LCA)LCA是一种严重的常染色体隐性遗传性的视网膜疾病，无特殊治疗手段。目前已发现25个基因突变与80% LCA病例相关[23]，其中对Leber先天性黑矇10型(Leber congenital amaurosis 10，LCA10)中CEP290基因突变的研究最为深入。有研究利用CRISPR/Cas9技术开发了一种候选基因组编辑疗法EDIT-101[24]，通过对IVS26序列突变两侧进行切割，去除了突变产生的异常剪接供体，使CEP290基因恢复正常表达，目前EDIT-101疗法已进入临床试验阶段[25]。利用CRISPR/Cas9技术进行基因片段的特异性切割，改变CEP290基因的功能表达，有望成为治疗LAC10的新途径。

3.2 视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)RP以慢性进行性视野缺损及色盲为主要特征，其治疗大多采用对症治疗及手术治疗，但效果不佳。目前已明确84个基因和7个候选基因与非综合征性RP相关，这些基因突变引起光感受器的退化，从而影响视网膜功能。其中遗传性RP分为常染色体显性遗传性RP(autosomal dominant RP，ADRP)、常染色体隐性遗传性RP(autosomal recessive RP，ARRP)与X连锁RP(X-linked RP，XLRP)。研究表明25%的ADRP由视紫红质(rhodopsin，RHO)基因的突变导致，而70%～90%的XLRP是视网膜色素变性三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)酶调节基因(GTPase regulator，RPGR)突变导致[26]。利用CRISPR/Cas9技术靶向切割P23H突变模型小鼠体内的RHO基因，减缓了光感受器的退化，改善了其视网膜功能[27]。2022年，Gumerson等[28]在自然突变的rd9小鼠体内靶向切除移码突变的OFR15基因后，恢复了部分光感受器中的RPGR基因功能，并且观察到RPGR突变相关的早期标志性疾病表型(如视锥蛋白的错误定位)已不复存在。这些研究展示了RP基因治疗的临床前研究进程及CRISPR/Cas9技术用于临床研究的可行性。

3.3 原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)POAG是一种由于房水排出途径受阻而导致眼压增高、视野损害的不可逆性疾病，其发病隐蔽，早期可没有任何症状。大约4%的欧美POAG患者被报道具有肌纤蛋白(myocilin，MYOC)基因突变。MYOC基因突变使蛋白质错误折叠，造成小梁网(trabecular meshwork，TM)的内质网压力增加，从而增高眼压。实验表明，在具有MYOC突变的人类TM细胞和小鼠模型中进行特异性切割，能够抑制突变MYOC的表达，从而降低眼压，阻止青光眼的发展[29]。另有研究表明，POAG患者的TM和房水中转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)的表达比非POAG患者高约1倍[30]，特异性抑制TM细胞中TGF-β2的表达后，小鼠眼组织中TGF-β2水平降低，成功降低了小鼠的眼压[31]。POAG家族是及时发现、治疗该疾病的关键，而眼压升高是其发生视野损害的关键因素，通过实验证明CRISPR/Cas9特异性基因切割可快速降低小鼠眼压，因此基因编辑有望成为POAG治疗的新途径。

3.4 先天性白内障(congenital cataract，CC)CC是一种严重的先天性致盲性疾病，若未及时治疗，将严重影响患儿视力发育，尽管手术治疗是有效的治疗方式，但术后并发症及术后维护十分复杂。根据报道，目前已发现超过266个基因突变与CC的发生有关[32]。研究表明，在Crygc基因显性突变白内障模型小鼠的受精卵中，通过敲除相关基因，校正了基因突变，其后代小鼠没有出现白内障[33]，说明通过CRISPR/Cas9技术敲除变异基因后性状可稳定遗传给后代。另外，实验证明水通道蛋白5(aquaporin5，AQP5)同样参与晶状体透明度的维持。Tang等[34]通过使用CRISPR/Cas9技术构建AQP5相关基因敲除小鼠模型，发现小鼠晶状体在大约6个月时发生轻度浑浊。

3.5 单纯疱疹性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)HSK是由角膜原发性或复发性单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus 1，HSV-1)感染引起的严重感染性角膜病，且具有潜伏性，易在机体抵抗力下降时反复发作。CRISPR/Cas9系统可以特异性在病毒基因组导入突变，从而降低病毒的活性，减轻病毒感染。ICP0和ICP4是HSV-1复制和再激活所需的2个重要基因。2020年，Chen等[35]以ICP0和ICP4作为靶点，利用CRISPR/Cas9技术高效、安全地抑制Vero细胞和小鼠三叉神经节神经元细胞培养中的HSV-1增殖，证明了这种基于CRISPR/Cas9的基因编辑是抗复发性HSV-1感染的有效方法。

3.6 眼科疾病基因编辑研究的局限性在目前的眼科疾病基因治疗的进展中，研究者们能够通过已有的各类基因测序工具，获得与某一疾病相关的部分特定基因序列，对已知的基因进行精准的基因编辑：在细胞或动物实验中构建疾病模型，通过靶向切割以验证基因功能、改变表达性状等，部分研究已进入临床试验阶段。但其发展仍存在部分问题：(1)在繁冗复杂的基因网络关系中，仍有大量编码或非编码序列的功能有待探索，基因之间的相互作用并不明确，这成为许多眼科疾病进入临床研究的重大阻碍；(2)包括结膜炎、角膜炎、眼内炎、睑缘炎、眼眶蜂窝织炎和泪囊炎等在内的细菌性炎症的治疗主要是经验性使用广谱抗生素。然而，广谱抗生素的全身应用导致革兰阳性菌和革兰阴性菌对一些用于治疗眼科感染药物的耐药性增加[36]，严重阻碍了疾病的治疗。因此，掌握药物敏感性规律或改善耐药性，可有效预防和控制眼部感染。

4 CRISPR/Cas9全基因组筛选技术在眼科治疗中的应用展望

4.1 疾病的发病机制研究CRISPR/Cas9全基因组筛选技术对探索先天性及环境因素导致的眼科疾病的致病机理具有重要意义。尽管目前已有部分突变基因为人们所知，但仍存在大量异常基因及非编码序列的功能有待阐述。如视网膜母细胞瘤的发生与Rb基因突变有关[37]，但部分基因突变患者会发生良性的视网膜瘤，或者发生其他的恶性肿瘤，如成骨肉瘤、小细胞肺癌等，并且不是所有患者均存在Rb基因突变。全基因组筛选技术将全面探索疾病的发病机制，为我们提供更多的潜在研究靶点。

4.2 基因治疗靶点的发现利用CRISPR/Cas9全基因组筛选技术在已知的突变基因基础上探索疾病发生的协同作用基因或调节因子或寻找新的免疫治疗靶点，将成为一些眼部疾病治疗的新方向。另外，眼部恶性肿瘤的合成致死靶点的发现将有助于恶性肿瘤的抑制和死亡。

4.3 耐药性研究目前眼科最常见的细菌感染为表皮葡萄球菌与铜绿假单胞菌，其细菌分离物对四环素、左氧氟沙星、头孢吡肟、氨苄西林等表现出较高耐药性[36]。另外，不少患者已出现普遍耐药。利用CRISPR/Cas9全基因组筛选技术对比药物治疗过程中的基因改变，揭示这些耐药发生的分子机制，可指明药物的进一步研发方向和联合用药的治疗靶点。

4.4 与CRISPR/Cas9基因编辑技术的结合应用CRISPR/Cas9基因编辑技术能够特异性识别并编辑目的基因，高效快速地验证基因功能，已在眼科疾病研究中得到广泛应用。全基因组筛选技术能够快速筛选疾病表型相关基因，即为基因编辑提供可能的目的基因片段，这将大幅度扩大基因功能探索的范围，提升效率。尽管它们的应用均受到脱靶效应的影响，但目前已出现一些降低脱靶效应的有效措施。

5 总结

综上所述，CRISPR/Cas9全基因组筛选技术是一种可广泛应用于各个领域的基因表型筛选方法，能够全面阐述疾病表型与基因改变的对应关系，具有特异性强、高效便捷等不可替代的优势。与RNAi筛选不同，这种筛选技术将功能缺失突变引入基因组DNA，并且可以靶向调控整个基因组的元件，包括启动子、增强子、内含子等。另外，RNAi通过mRNA结合和转录降解在转录后水平调控基因的表达，这种类型的表达抑制是暂时、可恢复的[38]，而GeCKO文库执行基因敲除，在基因组中产生永久性的变化。目前，该技术在各系统肿瘤相关基因、化疗药物耐药性、病毒感染治疗及先天性疾病研究等方面已取得部分进展，在细胞及动物实验中得到验证[39]。但存在部分问题有待解决：(1)目前常用的GeCKO文库主要包括人源与鼠源，并且价格昂贵，抑制了其广泛应用及发展。若由实验室搭建文库，则前期需要花费大量的时间成本，将严重影响实验进度；(2)进入细胞时依赖不同的载体，如慢病毒、AAV等，对于不同的细胞，不同载体的感染效率具有一定差异；(3)该技术是在全基因组范围内进行靶向识别并切割，故存在脱靶效应。

尽管如此，该技术在眼科各类疾病治疗中具有很大的应用前景，通过全方面探索眼科疾病相关基因并构建基因网络，结合CRISPR/Cas9技术验证其生物学过程，将“基因功能探索”与“目的基因编辑”相结合，有助于进一步的新药研发、耐药性分析等，将进一步促进基因治疗在眼科疾病中的有效应用。