基于网络药理学探究三子养亲汤治疗慢性阻塞性肺疾病的作用机制

王 英， 陈 秋

[1.浙江大学医学院附属第二医院长兴院区(长兴县人民医院)，浙江 湖州 313100；2.长兴县中医院，浙江 湖州 313100]

慢性阻塞性肺疾病是可防可控的常见病，以持续呼吸道症状和气流受限为特征，呼吸困难、咳嗽和(或)咳痰是其常见症状，我国该病患病率约为8.6%[1]，防治形势严峻。本病属中医“咳嗽”“喘病”“肺胀”等范畴，主要病机是正虚积损，急性加重期以痰热、痰浊、痰瘀为主兼气虚、气阴两虚，稳定期以气虚、气阴两虚为主兼有痰瘀[2]。

三子养亲汤出自《韩氏医通》，以紫苏子主气喘咳嗽，白芥子主痰，萝卜子主食痞兼痰，特为年老咳嗽，气喘、痰多而设，恰好契合慢性阻塞性肺疾病的呼吸困难，咳嗽、咳痰。Meta分析证明，三子养亲汤加减能改善慢阻肺患者的肺功能、血气分析结果和中医证候积分[3]，其加味能改善急性加重期症状[4]。然而，三子养亲汤治疗慢性阻塞性肺疾病的作用机制尚不明确，故本研究基于网络药理学方法[5]，构建三子养亲汤活性成分潜在靶点网络，并对活性成分与慢性阻塞性肺疾病发病机制相关蛋白进行计算机虚拟预测，以期为进一步研究和临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分的筛选 检索药物的活性成分。在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)中检索紫苏子、白芥子、萝卜子的活性成分，并根据ADME特征筛选活性成分，设定口服生物采用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18。

1.2 药物及疾病靶点的筛选 在TCMSP平台中逐一检索活性成分的靶点蛋白，并采用Uniprot数据库转换成靶基因。TCMSP未检索到数据的活性成分，在PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中获取其2D分子结构，然后采用SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)进行预测[6]，筛选可能性>0.11的条目，作为该药物活性成分可能的靶基因，以保证靶点的合理性和完整性。以“chronic obstructivepulmonary disease”为检索词，分别检索Genecards、OMIM数据库。Genecards仅纳入相关性得分>20的靶基因，OMIM纳入全部检索到的靶点基因。在R软件(version 4.0.3)中采用VennDiagram包(version 1.6.20)绘制疾病靶基因和药物靶点韦恩图，得到的三子养亲汤和慢性阻塞性肺疾病共有的网络靶点。

1.3 “药物-活性成分-靶点”网络构建 对共有网络靶点进行注释，标注对应的药物及其活性成分，形成药物-活性成分-靶点的映射关系。然后采用Cytoscape 3.8.2软件构建“药物-活性成分-靶点”网络图，同时获得网络节点表，根据degree值挑选出活性成分相关度高的网络靶点。根据以上数据，分析三子养亲汤治疗疾病的可能靶点。

1.4 靶点蛋白互作网络构建 通过STRING数据库(version 11.0,https://string-db.org/)构建靶点蛋白互作网络(PPI)。设定minimum required interaction score>0.9，获得蛋白互作关系图，分析功能蛋白质相互作用。将结果TSV格式导出，用R软件统计靶点之间相互作用，分析关键网络靶点。

1.5 GO、KEGG富集分析 在R软件中采用clusterProfiler包(version 3.18.0)和Bioconductor数据库(http://bioconductor.org/bioc Lite.R)用于相关分析包，对筛选出的靶点进行GO富集分析和KEGG信号通路富集分析，设定筛选阈值P-value<0.05，Q-value<0.05。对GO富集结果按照P值排序，各选取P值前10的条目进行可视化。分析网络靶点的生物过程、分子功能、细胞组成和作用的信号通路。

2 结果

2.1 活性成分及靶点 在TCMSP平台中检索得到潜在活性成分共22种，包括紫苏子16种，莱菔子3种，白芥子3种，见表1。在SwissTargetPrediction数据库中选取匹配度最高的10个靶点进行整合，删去重复(314个)后共得到药物靶点192个，包括紫苏子163个，芥子18个，莱菔子3个。

表1 三子养亲汤潜在活性成分

2.2 疾病靶点筛选与“药物-活性成分-靶点”网络图构建 从GeneCards数据库中获得疾病靶基因1 150个，从OMIM数据库中获得疾病靶基因1 231个，进行整合，删去重复的疾病靶点，共获得2 209个疾病靶点。药物靶点与疾病靶基因取交集后，得到共有靶点85个，见图1，提示三子养亲汤有可能通过这些靶点治疗慢性阻塞性肺疾病。将三子养亲汤潜在活性成分22种与上述85个共有靶点导入Cytoscape 3.8.2软件中，得到“药物-活性成分-靶点”网络图，见图2。由于连接度为1的基因表示在三子养亲汤组分药物治疗疾病的过程中，仅有1种活性成分作用于该基因，为了清晰展示各个节点的关系，故在网络图中隐去。其中柠檬甾二烯醇、花生四烯酸、木犀草素连接的靶点基因较多；NCOA2、PGR、PTGS1、PTGS2、NR3C2、PPARG基因连接的药物较多。红色圆点表示靶点基因，紫色方块表示紫苏子的活性成分，蓝色方块表示白芥子活性成分，绿色方块表示莱菔子活性成分。越靠近圆心字体越大，连接度越大，表示该成分连接的靶点(或该靶点承接的活性成分)越多。

2.3 蛋白互作网络关系图(PPI) 将85个靶点输入String数据库，得到蛋白互作网络关系图(图3A)。圆点代表不同的靶点，不同颜色的连线表示不同的证据类型。用R软件构建各靶点连接数直方图，由图3B可知，连接度最高的靶点依次为Akt1、MAPK1、JUN、RELA、IL6、MAPK14、EGFR、ESR1、MYC、VEGFA、IL2、IL4等，提示这些基因可能是关键作用靶点。

2.4 GO富集分析 三子养亲汤参与1 844个生物过程、110个分子功能、43个细胞组分，根据P值分别列出了GO富集分析中排名前10的结果，见图4。

主要涉及的生物过程有肌细胞、平滑肌细胞增殖、增殖及其调控，其相关靶点有HMGCR、PPARG、TERT、PTGS2、MAPK1、Akt1、GJA1、JUN、EGFR、CDKN1A、MMP2、MMP9、IL10、IL6、MDM2、HMOX1、IFNG、GSTP1、MAPK14、RBP4；上皮细胞的增殖及调控，凋亡相关的过程，其相关靶点有AR、ESR1、PPARG、VDR、SCN5A、CCND1、MAPK1、ALOX5、Akt1、VEGFA、MYC、F3、GJA1、BAX、JUN、EGFR、IL10、RB1、IL6、TP63、ERBB2、HMOX1、PSEN1、AGTR1；炎症反应的调节，其相关靶点有CYP19A1、ESR1、PPARG、NOS2、PTGS2、RELA、TNFRSF1A、ALOX5、TNFRSF1B、EGFR、MMP9、IL10、RB1、IL6、NFKBIA、IL2、IFNG、IL4、GSTP1、MAPK14、AGTR1、PLA2G2A；氧化应激反应，其相关靶点有G6PD、PTGS2、PTGS1、RELA、MAPK1、CASP3、ALOX5、Akt1、BCL2、JUN、EGFR、MMP2、MMP9、IL10、IL6、MDM2、APP、HMOX1、GSTP1、MET、PSEN1。

主要涉及的分子功能有磷酸酶结合和蛋白磷酸酶结结合，其相关靶点有PTPN1、HMGCR、PPARG、SLC6A3、MAPK1、Akt1、BCL2、EGFR、ERBB2、MET、MAPK14；核受体活性，配体激活的转录因子的活性，类固醇结合、生长因子受体结合，其相关靶点有AR、ESR1、ESR2、PPARG、VDR、NR3C2、RARB、SERPINA6、VDR、NR3C2、ABCA1、CETP等。

细胞组分结果提示药物的作用靶点主要位于脂筏、膜微区、膜区、细胞外器膜等处。

2.5 KEGG富集分析 三子养亲汤的交集基因共涉及56条通路，根据P值分别列出了排名前20的通路，见图5，涉及的通路主要集中于癌症相关通路，其中与慢性阻塞性肺疾病联系密切有小细胞肺癌和非小细胞肺癌。其他相关通路还有T细胞受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、细胞凋亡、Jak-STAT信号通路等。选择主要信号通路Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路绘制通路图，见图6～7。

3 讨论

既往研究发现，三子养亲汤中的活性成分有对羟基苯乙腈、异香草酸、对羟基苯甲醛、胡萝卜苷[7]、反式芥子酸、对羟基苯甲酸、β-谷甾醇[8]等。本研究发现，柠檬甾二烯醇、花生四烯酸、木犀草素可能是其重要活性成分。

活性成分连接个数最多的靶基因与激素受体和炎症相关，如NCOA2、PGS、PPARG等。既往研究表明，慢性阻塞性肺疾病患者的核受体共激活受体(NCOA2)基因表达升高[9]，PPAR-γ激动剂(吡格列酮)对于慢性阻塞性肺模型巨噬细胞和嗜中性粒细胞具有清除效应[10]。蛋白互作分析得到的关键基因[11]与免疫调控、炎症反应、血管和肺上皮细胞凋亡等相关，如Akt1、MARK1、VEGFA等。蛋白激酶B1(Akt1)的抑制剂和激活剂均对慢性阻塞性肺疾病表现出治疗效果[12],阻断MAPK通路可以控制慢性阻塞性肺疾病进展[13]。研究发现，三子养亲汤能降低支气管哮喘模型大鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、TNF-α水平[14]。血管内皮生长因子A(VEGFA)参与血管生成和内皮细胞生长，肺气肿中VEGF活性下降，导致肺叶上皮细胞凋亡，提高了肺泡壁对氧化应激和蛋白酶的敏感性[15]。此外，雌激素受体(ESR)也值得关注，肺部存在所有ESR亚型，慢性阻塞性肺疾病患者肺部雌激素代谢酶mRNA表达存在变化，表明雌激素与疾病有关[16]。

GO功能分析显示，三子养亲汤可能调控了气道平滑肌功能、上皮细胞增殖和凋亡等生物过程，磷酸酶结合、蛋白磷酸酶结合、激素核受体活化等分子功能。研究发现，气道平滑肌障碍会影响气道对刺激、重塑和纤维化的反应以及肺的顺应性[17]；上皮细胞增殖和凋亡异常则导致气道病变[18]；蛋白磷酸酶2A(PP2A)是调节慢性阻塞性肺疾病炎症的关键因素[19]。KEGG通路分析显示，三子养亲汤涉及的通路与癌症相关，有实验证实慢性阻塞性肺疾病是肺癌发病的危险因素之一，且在炎症、氧化应激、基因损伤修复以及免疫中存在相同机制[20]，提示三子养亲汤或可改善其远期结局。同时，KEGG分析所涉及的NOD受体通路参与固有免疫，T细胞受体通路参与特异性免疫，研究表明三子养亲汤能够通过调节Th17/Treg平衡失调抑制哮喘大鼠的气道炎症[21]，提示三子养亲汤可能对免疫应答具有调控作用。Jak-STAT信号通路参与细胞增殖，既往研究表明三子养亲汤联合西医治疗哮喘可改善气道重塑[22-23]，提示三子养亲汤对气道重塑的调控。

综上所述，三子养亲汤治疗慢性阻塞性肺疾病，可能通过靶向基因NCOA2、Akt1、PTGS1/2、MAPK1/14、RELA等，调控磷酸化和核受体活性，调控T细胞受体通路、NOD样受体通路、Jak-STAT通路等，调节上呼吸道平滑肌细胞、上皮细胞的增殖与凋亡，炎症反应，氧化应激反应，进而发挥治疗作用。