正交试验优选补血养元合剂提取工艺

陈艳熙，陈安利，马 卓

(湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068)

月经问题对年轻女性生活、工作及健康有很大的影响[1]。经期常伴有多种症状，如轻度抽筋、力竭等，严重者甚至会导致不孕[2-4]。中药因其多靶点、副作用少等优势，深受女性患者的喜爱，而月经不调等症状多与气血不足，阴虚等有关，故可选择补肾益气的药方进行调理[5]。补血养元合剂由淫羊藿、山茱萸、月季花、香附等组成。其中，淫羊藿、黄芪属君药，起补气升阳功效；月季花等为臣药，起活血调经功效；山茱萸等为佐药，起补肾养阴功效；香附等为使，起疏肝行气功效。使合剂具有补肾益气、养血调经及治疗阴阳平衡失调所致的月经不调、痛经和不孕症的功效，适应于各种贫血、证属气血亏虚者[6]。

本实验为考察不同提取因素对补血养元合剂质量的影响，设计正交试验优选出合剂的最佳水提工艺，为合剂的进一步开发奠定基础。

1 材料

1.1 试药

淫羊藿、山茱萸、月季花、香附等中药材购自湖北强康中药饮片公司，经鉴定符合《中国药典》2020版一部该药材项下标准。

淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定研究院，纯度98.9%，供含量测定用)。乙腈、甲醇为色谱纯，甲酸为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 实验仪器

R206B旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)，赛默飞U3000高效液相色谱仪(匠析生物科技有限公司)，H1650-W医用离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，ZFI-Ⅱ紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)，C21-SN216多功能电磁炉，实验室超纯水器(武汉优普纯水设备有限公司)。

2 方法与结果

2.1 药材吸水率试验

为提高中药饮片水提实验加水量的准确度，确保饮片中有效成分的溶出度，提高补血养元合剂质量，对中药饮片的吸水量进行考察。按处方比例准确称取淫羊藿、山茱萸、月季花、香附等中药饮片共3组，每组重315 g，分别用纱布包裹，加入10倍量水浸泡，常温(25 ℃)放置，分别在0.5、1、1.5、2、2.5、3、12 h时取出药材，滤除多余水分，以无液体流出为标准，称量湿饮片的重量记录数值，按如下公式计算吸水率[7-8]，测定结果见表1。

表1 中药饮片吸水率 %

由表1可知，3 h之后药材的吸水率增加且缓慢达到饱和，测得饱和吸水率平均值为118.74%，因此首次提取时需多加1倍水。

2.2 淫羊藿苷含量测定[9-11]

2.2.1色谱条件采用十八烷基硅烷键合硅胶分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：乙腈(A)-0.2%甲酸(B)。流速1 mL/min，柱温35 ℃，进样量20 μL，检测波长260 nm。梯度洗脱：0～20 min，20%A；20～30 min，20%～40%A；30～30.5 min，40%～20%A；30.5～33 min，20%A。

2.2.2对照品溶液的制备精密称取淫羊藿苷对照品1.0 mg，加甲醇溶解，定容至100 mL容量瓶，摇匀，即得10 μg/mL对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备取制备好的合剂1 mL，甲醇定容至100 mL，静置一夜后，0.22 μm滤膜过滤。滤液即为供试品溶液。

2.2.4阴性对照溶液的制备按处方配比准确称取除淫羊藿以外的其他中药饮片，处理方法同“2.2.3”。

2.2.5专属性试验对上述对照品、供试品、阴性溶液进行色谱分析，结果见图1。结果显示阴性无干扰，说明方法专属性良好。

图1 高效液相色谱

2.2.6线性关系考察精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL对照品溶液，用甲醇定容稀释成2、4、8、16、32 μg/mL，依次进行色谱分析。以浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y进行回归(图2)，得回归方程：y=0.2798x-0.0617(R2=0.9999)，说明淫羊藿苷在2～32 μg/mL范围线性关系良好。

图2 淫羊藿苷标准曲线

2.2.6精密度实验重复取6次对照品溶液，每次20 μL进行色谱分析。测得淫羊藿苷峰面积RSD为 0.294%，表明仪器精密度良好。

2.2.7重复性实验按处方称取饮片6份，平行制备6份供试品溶液进行色谱分析。测得淫羊藿苷峰面积RSD为 1.24%，说明该方法重复性良好。

2.2.8稳定性实验分别在0、2、4、6、8、10、24 h取同一供试品溶液20 μL进行色谱分析。测得淫羊藿苷峰面积RSD为1.73%，说明淫羊藿苷在24 h内性质稳定。

2.2.9加样回收率实验取9份供试品溶液(每份含9.359 μg淫羊藿苷)，分为3组，各组分别加入淫羊藿苷标准品高中低剂量，用甲醇定容后进行色谱分析，结果见表2。

表2 加样回收率实验结果

实验测得淫羊藿苷平均加样回收率为99.97%，RSD为1.09%，说明该含量测定方法准确可靠。

2.3 干膏得率测定

取制备好的合剂300 mL，置于干燥至恒重的坩埚中，水浴蒸干，再于烘箱中105℃干燥3 h，移至干燥器中冷却30 min，精密称定其质量。

干膏得率=干膏质量/原药材质量×100%

2.4 单因素考察实验

2.4.1加水倍数按处方配比精密称取中药饮片，分别加4、6、8、10、12倍水，提取2次，每次1 h，合并2次煎煮液并浓缩，得到提取液。由图3可知，随水倍数增加，淫羊藿苷含量和干膏得率呈先增加后下降趋势。究其原因，可能是当加水量过少，饮片未能浸泡完全，有效成分及其他物质溶出率低；当加水量过多，饮片中除淫羊藿苷外的其他物质也充分溶出，物质间可能发生了相互作用。当加入8倍水时，淫羊藿苷含量和干膏得率达到最大值，故选择6倍、8倍、10倍水为后续优化参考水平。

图3 加水倍数

2.4.2提取时间按处方配比精密称取中药饮片5份，分别提取30、60、90、120、150 min，均加入8倍水，提取2次，合并2次煎煮液并浓缩，得到提取液。由图4可知，随着提取时间延长，淫羊藿苷含量和干膏得率呈现先增加后下降趋势，可能是提取时间太短使得饮片中溶出的成分过少，而长时间提取则会使溶出的成分被破坏。淫羊藿苷含量和干膏得率在提取1h时达到最大值，故选择0.5、1、1.5为后续优化参考水平。

图4 浸提时间

2.4.3提取次数按处方配比精密称取中药饮片3份，依次提取1、2、3次，均加8倍水，每次提取1 h，然后将煎液过滤并浓缩，得到提取液。由图5可知，淫羊藿苷含量和干膏得率在提取2次后达到最大值，可能原因是提取次数过少，饮片成分不能充分溶出，而提取次数过多，则溶出的成份被破坏或成分之间发生相互作用使其含量降低。故选择提取次数为1次、2次、3次为后续优化参考水平。

图5 浸提次数

2.5 水提正交试验方案设计

用L9(34)正交表设计试验，正交试验因素水平表见表3。测定淫羊藿苷含量(a)和干膏得率(b)进行综合评分(Y)，其中淫羊藿苷含量占评分70%，干膏得率占评分30%。直观结果见表4，方差分析见表5。

表3 因素水平表

表4 提取工艺正交实验直观分析表

表5 方差分析结果

从表4中极值R可以看出，影响淫羊藿苷含量的3个因素次序为：提取次数>加水倍数>提取时间。与方差分析表所分析的“因素A和因素C对实验有显著影响”结论相同。根据以上实验结果，考虑到成本和提取时长，确定最佳提取工艺为A2B1C2，即8倍水提取2次，每次1 h。

2.6 验证实验

按处方配比称取中药饮片3份，按优化工艺A2B1C2(8倍水提取2次，每次1 h)做3次平行试验，测定干膏得率和淫羊藿苷含量。试验结果见表6，淫羊藿苷含量为27.55 μg/mL，干膏得率为36.26%。验证结果与正交结果相近，说明优化的工艺条件具有可行性。

表6 验证实验结果

3 结束语

本研究采用正交法优选补血养元合剂的提取工艺。结果表明，与常规提取条件所得结果相比，优化工艺合剂中有效成分含量显著提高，且最佳工艺条件为8倍水提取2次，每次1 h。验证实验表明，本法具有可行性，且优化工艺操作简单、有可靠性，为制剂的大规模制备奠定了基础。

本研究重在优化补血养元合剂的提取工艺，提高有效成分的溶出度，若要保证临床安全用药，确定临床用药剂量，则还需进行药理学和毒理学实验。