辣椒 CaTPS8基因克隆与表达分析

赵淑芳，苟秉调，魏 敏，段盼盼，王永富，杨 楠，张高原，魏兵强

(甘肃农业大学 园艺学院，兰州 730070)

海藻糖(Trehalose)是一种由两个吡喃环葡萄糖分子以α，α-1，1糖苷键连接而成非还原性双糖[1-2]。海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)是海藻糖合成途径中的两种关键酶。首先，UDP-葡萄糖(UDPG)和葡萄糖-6-磷酸在TPS的催化下合成海藻糖-6-磷酸(T6P)，其次，通过TPP将T6P去磷酸化生成海藻糖[3]。海藻糖作为一种碳水化合物的储存形式、能量来源物质和应激保护物质，普遍存在于细菌、酵母、真菌、线虫和昆虫及脊椎动物中[4-5]。在微生物中，海藻糖还通过稳定蛋白质结构和生物膜起到抵御高温和干旱胁迫的作用，但其在植物中的含量极低[6-7]。尽管如此，微量的海藻糖及其生物合成的中间体T6P在植物的生长发育和代谢中起着关键作用[1,8]，其参与植物的生物合成[1]、胚胎形成[1]、碳同化[9]、衰老调控[9]、淀粉降解[10]、细胞分化[10]以及成花诱导[11-12]等过程。而TPS是海藻糖代谢过程中的一个关键酶，也有研究表明，TPS通过改变T6P的水平影响发育和代谢过程[1]，故TPS在植物生长发育和抗逆性中的作用备受关注。

TPS在高等植物响应非生物胁迫中具有重要的调控作用。目前大多数高等植物基因组中都含有TPS基因家族[13]。过表达TPS或TPP基因的拟南芥[14]、烟草[5,15-16]、水稻[17-18]、马铃薯[5,19]和番茄[20]等转基因植物通常都表现出对非生物胁迫的耐受性增强。将酵母TPS1基因 (ScTPS1)导入番茄(Solanumlycopersicum)，提高了番茄植株的叶绿素和淀粉含量，增强了对干旱、盐和氧化胁迫的耐受性[20]。据报道，AtTPS1基因在烟草中的异体表达可以提高烟草对干旱、盐和极端温度等非生物胁迫的耐受性[21]。同样，水稻TPS1(OsTPS1)基因的过表达提高了水稻幼苗对冷、高盐和干旱处理的耐受性，但不引起显著的表型变化[22]。在玉米(Zeamays)中，TPP过表达显著增加了干旱和正常情况下的产量[23]。在拟南芥中，TPS1功能的丧失影响糖代谢和脱落酸(ABA)的生物合成，从而导致胚胎发育延迟，并扰乱营养生长[24-25]。这些研究都表明TPS基因对非生物胁迫的响应具有重要的作用，其在作物遗传改良、改善品质和提高产量中具有巨大潜力。

辣椒(CapsicumannuumL.)属于茄科(Solanaceae)辣椒属(Capsicum)，是一种重要的蔬菜作物，还作为香料作物、观赏植物和增值加工产品在世界范围内广泛种植，具有很高的经济价值和社会效益[26]。在自然界中，植物面临着来自外界环境的诸多挑战，而海藻糖代谢是植物提高抗逆性的重要途径之一。甘肃农业大学园艺学院分子育种课题组(以下称本课题组)前期在辣椒全基因组中共鉴定出11个辣椒TPS基因，依次命名为CaTPS1～CaTPS11[27]。本研究克隆得到CaTPS8基因CDS序列，并利用生物信息学的方法对CaTPS8编码蛋白序列及结构进行分析，构建系统进化树分析不同物种间CaTPS8蛋白的亲缘关系。同时利用qRT-PCR分析CaTPS8基因的组织特异性表达，以及该基因在低温、IAA、ABA、SA、GA3和MeJA等非生物胁迫下的表达模式。为后续深入研究CaTPS基因的功能奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 植物材料 供试材料为辣椒品种‘强丰101’，由甘肃农业大学园艺学院分子育种实验室保存。挑取籽粒饱满的种子用纱布包好，先用 55 ℃热水温汤浸种20 min，再用20%的磷酸三钠消毒20 min，28 ℃催芽72 h后播种于基质穴盘中，置于光照培养箱中培养。光周期参数设置为16 h / 8 h(光照/黑暗)，温度为28 ℃/23 ℃(白天/黑夜)，光照度为12 000 lx。取根、茎、叶、花、幼果果肉、商品果果肉、成熟果果肉、幼果胎座、商品果胎座和成熟果胎座用于组织特异性 表达。

1.1.2 试验试剂 大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态Trans1-T1细胞购自北京全式金(北京)生物公司，RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒和荧光定量PCR试剂均购于天根生化科技有限公司(北京)，DNA凝胶回收试剂盒购于擎科生物技术有限公司，反转录试剂PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和克隆载体pMDTM18-T Vector Cloning Kit均购于宝生物工程(大连)有限公司，2×TaqPCR MasterMix购自中科瑞泰(北京)生物公司，IAA、GA3、MeJA和ABA购自北京酷来搏科技有限公司，SA购自于上海沪试公司。

1.2 方 法

1.2.1 材料处理 低温处理：待穴盘种植的辣椒幼苗生长至6片真叶时进行低温处理，处理时光照培养箱的参数设置为：16 h/8 h(白天/黑夜)，温度23 ℃/18 ℃(白天/黑夜)，光照度为2 000 lx。分别于处理0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h取植株第4至第6片真叶，置于液氮速冻后，于-80 ℃保存，备用。

1.2.2 激素处理 种子经消毒催芽后利用无土栽培技术使其在hoagland营养液中生长，人工气候箱中温度设为28 ℃/23 ℃(白天/黑夜)，光周期16 h/8 h(白天/黑夜)，白天12 000 lx光照。当辣椒幼苗长到6片真叶时，进行非生物胁迫处理，向营养液中分别加入150 mg/L脱落酸(Abscisic acid, ABA)、200 mg/L赤霉素(Gibberellic acid, GA3)、300 mg/L水杨酸(Salicylic acid, SA)、0.02 mg/L茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate, MeJA)和30 mg/L吲哚乙酸(Indole acetic acid, IAA)5种激素，对照组仅用营养液模拟处理。分别于处理0 h、1h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h取植株第4至第6片真叶，液氮速冻后，置于 -80 ℃保存，备用。

1.2.3CaTPS8基因克隆 从本课题组鉴定得到的CaTPS基因家族成员信息中得到CaTPS8基因参考序列，设计CaTPS8基因的特异性上游引物和下游引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。提取‘强丰101’叶片RNA，以反转录得到的cDNA为扩增模板。25 μL PCR 反应体系包括：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL 和上下游引物各1 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性 5 min； 94 ℃变性 30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 40 s， 35个循环；72 ℃延伸10 min后4 ℃保存。所得扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。采用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，与pMD 18-T连接后转化Trans1-T1感受态，将菌液涂布于含有100 mg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，置于37 ℃培养箱中倒置过夜培养，挑取单菌落进行PCR鉴定，选取阳性克隆摇菌后提取质粒再次验证，送至擎科生物技术有限公司(西安)进行测序。保存测序正确的菌液，完成克隆。

1.2.4CaTPS8生物信息学分析 利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)预测CaTPS8的理化性质，蛋白跨膜结构采用TMHMM Server v.2.0在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测，在NCBI数据库中预测CaTPS8编码蛋白的保守结构域，利用SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行蛋白信号肽预测，利用NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)进行蛋白磷酸化位点预测，利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)进行蛋白亲疏水性预测，蛋白二级结构预测采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)，三级结构预测采用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)。通过NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Blastp对辣椒CaTPS8的氨基酸序列进行同源检索，获得其他物种的同源序列，并利用DNAMAN软件对氨基酸序列进行多序列比对，然后采用邻近法(Neighbor- joining method，NJ)在MEGA中构建系统发育树，Bootstrap 设置为 1 000次重复。

1.2.5CaTPS8基因表达模式分析 提取辣椒不同组织以及不同处理叶片的总RNA，按照试剂盒的方法反转录得到cDNA。以辣椒Actin(GenBank Accession：GQ339766.1)为内参基因，根据CaTPS8序列设计荧光定量PCR引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。qRT-PCR反应在StepOnePlus(美国应用生物系统中国公司产品)仪器上完成，反应体系包括SYBR Green Master mix 10 μL，ddH2O 6 μL，上下游引物各 1 μL和cDNA 2 μL；扩增程序为： 95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环。使用2-△△CT法计算CaTPS8基因的相对表达量。利用SPSS 22软件对数据进行差异显著性分析(P<0.05)，使用Origin 2019作图。

表1 CaTPS8基因引物信息及功能Table 1 Primer information and function of CaTPS8 gene

2 结果与分析

2.1 辣椒 CaTPS8基因的克隆

利用CaTPS8-F/CaTPS8-R(表1)对辣椒品种‘强丰101’的cDNA进行扩增，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条2 500 bp左右特异性条带(图1)，与预期结果一致。PCR产物经回收纯化后转化，筛选阳性克隆送测序。经测序产物长度为2 553 bp，编码850个氨基酸(图2)。

M.DNA标准物5 000；1～2. CaTPS8基因的cDNA PCR产物

图2 CaTPS8全长核苷酸序列及预测氨基酸序列Fig.2 Full-length nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of CaTPS8

2.2 CaTPS8的蛋白结构及系统进化关系分析

对CaTPS8的理化性质分析表明，该蛋白的分子质量为96 ku，理论等电点为 5.65，不稳定系数为48.09，推测为不稳定蛋白，脂肪系数为 87.69。通过保守结构域分析，发现CaTPS8该蛋白含有Glyco_transf_20(位于59～543 aa)和GT20_TPS(位于59～542 aa)保守结构域，以及非特异性保守结构域PLN02205(位于1～843aa)，属于TPS基因家族(图3)。蛋白结构预测显示CaTPS8蛋白没有蛋白跨膜结构(图4)和信号肽序列(图5)。NetPhos 3.1分析表明CaTPS8蛋白具有50个丝氨酸、13个苏氨酸、12个酪氨酸的磷酸化位点(图6)，进一步预测发现CaTPS8蛋白属于亲水性蛋白(图7)。二级结构分析发现CaTPS8的二级结构由42.47%的α-螺旋、 34.59%的无规则卷曲、17.88%的延伸片段和 5.06%的β-转角构成(图8)。通过SWISS-MODEL同源建模预测CaTPS8蛋白的三级结构，结果也显示该蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主 (图9)。

图3 CaTPS8蛋白保守结构域预测结果 Fig.3 Prediction of CaTPS8 protein conserved domain

图4 CaTPS8蛋白跨膜结构预测Fig.4 Transmembrane structure prediction of CaTPS8 protein

图5 CaTPS8蛋白信号肽预测Fig.5 Signal peptide prediction of CaTPS8 protein

图6 CaTPS8蛋白磷酸化位点预测Fig.6 Phosphorylation site prediction of CaTPS8 protein

图7 CaTPS8蛋白疏水性/亲水性预测Fig.7 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of CaTPS8 protein

蓝色. α-螺旋；紫色. 无规则卷曲；红色. 延伸片段；绿色. β-转角

图9 CaTPS8蛋白的三级结构预测Fig.9 Tertiary structure prediction of CaTPS8 protein

通过Blastp比对，从NCBI中下载其他物种的同源蛋白序列，包括马铃薯Solanumtuberosum(XP 006358103.1)、番茄Solanumlycopersicum(XP 004233035.1)、葡萄Vitisvinifera(XP 002268174.1)、木薯Manihotesculenta(XP 021596125.1)、甜瓜Cucumismelo(XP 008439718.1)、黄瓜Cucumissativus(XP 011658255.1)、大豆Glycinemax(XP 003540002.1)、拟南芥Arabidopsisthaliana(NP 001321475.1)、水稻OryzasativaIndica Group (AEB53178.1)、小麦Triticumaestivum(KAF7030703.1)、高粱Sorghumbicolor(XP 002440081.1)。同源序列比对结果显示CaTPS8蛋白与番茄、马铃薯同源序列相似度最高，分别为87.78%和86.92%，与高粱相似度最低，为 64.76%。系统进化树也显示CaTPS8与番茄、马铃薯在同一分支上，并且Bootstrap值高达100(图10)。推测CaTPS8基因的功能可能与马铃薯、番茄中的同源基因功能相似。

图10 CaTPS8系统进化关系分析Fig.10 Phylogenetic relationship analysis of CaTPS8

2.3 CaTPS8基因的表达模式分析

2.3.1CaTPS8基因的组织表达特异性 实时荧光定量PCR分析结果表明(图11)，CaTPS8基因在辣椒不同组织中表达存在显著差异，其在花中的相对表达量最高，其次是叶和茎，在幼果胎座中表达量最低，且花中的表达量约为幼果胎座的40倍。除了幼果果肉，CaTPS8基因在辣椒其他发育时期的果肉和胎座中表达量都比较低。

YFF.幼果果肉；YFP.幼果胎座；BFF.商品果果肉；BFP.商品果胎座；RFF.成熟果果肉；RFP.成熟果胎座；R.根；S.茎；L.叶；F.花；不同小写字母表示 CaTPS8基因表达量在辣椒不同组织间差异显著(P<0.05)

2.3.2CaTPS8基因在不同非生物胁迫下的表达模式分析CaTPS8基因在经过低温处理后在辣椒叶片中的表达量显著上调(图12)，在处理3 h时表达量最高，约为对照的25倍。但其表达量在处理3 h之后又迅速下降，然后在处理12～72 h时保持较低的水平，且与对照基本一致。所以CaTPS8基因在低温处理后表达量呈现显著升高又迅速下降后保持稳定的趋势。

不同小写字母表示 CaTPS8基因表达量在不同非生物胁迫下差异显著(P<0.05)

在SA、IAA、ABA、GA3和MeJA 5种激素处理下CaTPS8基因的表达量均下调(图12)。其中，在SA处理后1 h下调最明显，约为对照的 1/10。随着处理时间的推移，CaTPS8基因的表达量开始上升，在处理48 h时达到峰值，并超过对照的表达量。IAA、GA3处理下CaTPS8基因的表达量均呈先下降后上升再下降的趋势，但在处理前期IAA中的下降更显著，且IAA处理下在24 h达到峰值，而GA3处理下峰值出现在 1 h。CaTPS8基因的表达量在ABA处理下大致为先下调后上调的趋势，在处理3 h达到最大值，且在处理后期表达量基本稳定。在MeJA处理下CaTPS8基因的表达量大致呈逐步降低的趋势。

3 讨 论

植物的生长发育经常受到各种不利环境的影响，包括干旱、盐碱地、冷害和热害等[28]。这些非生物胁迫是影响作物品质和产量的重要因素。而海藻糖代谢途径在调节蔗糖的利用和分配、协调源库关系、碳水化合物的有效利用等方面具有重要作用[29-30]。海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)对应激反应和海藻糖代谢至关重要。越来越多的研究表明，一些TPS/TPP基因家族成员与非生物胁迫响应有关，并在改良作物品质、提高作物产量以及抗逆性方面发挥重要作用[23,31]。水稻中的海藻糖可以在低水平NaCl处理下积累，外源添加海藻糖可以降低NaCl对水稻的生长抑制作用[32]。过表达AtTPS1显著提高了拟南芥的抗旱性[33]，过表达OsTPS1能提高水稻对非生物胁迫的耐受性[22]，激活OsTPP1表达可以提高水稻的耐冷性[15]，这些研究证实了TPS成员在植物生长发育和逆境应答中的功能特性。

本研究从辣椒中克隆出的CaTPS8基因长度为2 553 bp，共编码850个氨基酸。通过NCBI比对，选取不同作物的同源序列构建系统进化树，发现CaTPS8与马铃薯和番茄亲缘关系最近，与高粱亲缘关系相对较远。这可能是由于辣椒、马铃薯和番茄都属于双子叶茄科植物，因此CaTPS8在这两种植物中存在较高的同源保守性。从玉米中克隆出的cDNAs结果显示，TPS-2和TPS-3含有Glyco_transf_20和 GT20_TPS两个保守结构域，TPP-1基因有一个Trehalose_PPase结构域[34]。Wang等[35]研究发现，短柄草BdTPS和BdTPP基因也显示了这种类型的结构域，这与本研究结果一致，即使在不同物种中，这些蛋白也具有相同的催化位点，并且大多数保守结构域参与酶-底物结合和海藻糖-6-磷酸合成[34]。

本研究对CaTPS8的组织特异性表达分析发现，该基因在花中相对表达量显著高于其他组织，表明该基因可能调控辣椒花的发育过程。Paul等[8]发现，即使在其他诱导环境下，AtTPS1的缺失也会导致拟南芥开花延迟，这表明AtTPS1在花期的及时启动中是必需的。此外，Satoh-Nagasawa等[36]提到海藻糖可能在一个特定的发育途径中起信号作用，因为他们证明了一种功能性的TPP酶可以作用于RA1转录因子的上游，调控花序分枝。这些结果表明，TPS和TPP基因可能在调控植物从营养生长向生殖生长的转变中发挥关键作用。

荧光定量PCR分析发现，CaTPS8的表达受到低温胁迫的诱导，在处理前期显著上调，这与甜瓜CmTPS7的表达一致[37]。辣椒CaTPS8最初的表达上调可能是促进T6P含量的增加，从而诱导胁迫信号转导相关基因的表达。但在葡萄中，具有TPS活性的VvTPS1对低温并不敏感[38]，这可能与物种间的差异性有关。本研究还发现，CaTPS8基因可以响应IAA、ABA、SA、GA3和MeJA 5种激素的胁迫，其表达均受到不同程度的抑制，证实CaTPS8基因参与激素胁迫的应答调控。同样，非生物胁迫、激素和蔗糖处理导致黄瓜CsTPS6的表达大幅下降[39]，而玉米ZmTPS基因在盐和低温胁迫下诱导表达[40]。此外，OsTPP2基因的表达受到低温、盐胁迫、干旱胁迫以及ABA等多种胁迫因子的调节[41]。马铃薯StTPS基因的表达模式也受不同胁迫和激素的调控[42]。而拟南芥中AtTPS1基因的过表达导致转基因植物对外源ABA不敏感，表明AtTPS1基因表达与ABA代谢之间存在相互作用[43]。同样，在拟南芥种子萌发和气孔关闭过程中，TPS5 作为ABA信号转导的负调控因子，参与改变海藻糖含量和硝酸还原酶(Nitrate reductase，NR)活性[44]。