葡萄有机酸的研究进展

朱磊，陈芸华，胡禧熙，李新月，战川，吕珊珊

(1. 黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319; 2. 黑龙江省农产品加工工程技术研究中心，黑龙江大庆 163319; 3. 黑龙江省农科院大庆分院，黑龙江大庆 163319）

葡萄果实风味是衡量葡萄品质的重要指标，受糖酸组分、芳香物质、单宁、醇、酯类等多种成分的综合影响，其中有机酸的含量和组成是衡量葡萄成熟度及酿酒品质的主要参数[1]。葡萄果实发育和葡萄酒发酵过程中会合成多种有机酸，这些有机酸的种类和含量会影响酒的生物稳定性、风味品质和陈酿潜力[2-3]。自上世纪50年代以来，大多是关于葡萄有机酸含量及影响因素的研究报道，而有关有机酸的运载与合成代谢机理的研究报道十分有限。本文从葡萄有机酸的含量和组成出发，综述了近年来国内外学者关于葡萄有机酸的研究进展，重点介绍了葡萄有机酸的合成，提出了未来的研究方向、思路和问题，以期为葡萄有机酸的研究提供一定参考。

1 葡萄中的主要有机酸

无机酸和有机酸是果实中的两类酸，其中无机酸的总含量约0.1～1 g·L-1，源于植物根系从土壤中获取的硫酸、盐酸等无机酸类，以酒石酸、苹果酸和柠檬酸等为代表的有机酸类则由植物自身合成[4]。在葡萄成熟过程中，果实组织中的有机酸参与三羧酸循环（TCA循环），同时也会受到糖酵解、糖原异生、光合作用和呼吸作用等代谢基质的影响[5]。根据碳架来源，苹果酸、酒石酸和柠檬酸属于脂肪族羧酸中的二元羧酸[6]（图1）。一般而言，一种果实以一种或两种有机酸为主，其他有机酸影响甚微[7]。葡萄果实中酒石酸含量占总酸的42.8%～77.0%，是典型的酒石酸型果实，其次是苹果酸，占总酸的10.3%～41.6%[8-9]。虽然苹果酸和酒石酸具有相似的化学结构，但二者合成途径不同，苹果酸是通过糖酵解和TCA循环生成，而酒石酸则是抗坏血酸代谢的产物。

图1 葡萄果实中主要有机酸的化学结构式Figure 1 Chemical structure formula of main organic acids in grape fruit

1.1 酒石酸

酒石酸（Tartaric acid，TA）分子式为C4H6O6，具有3种异构体，在植物中通常以L(+)-TA存在。葡萄中酒石酸的含量较其他有机酸多，酸感也较浆果中其他有机酸更浓烈，同等浓度下酒石酸酸味约为柠檬酸的1.2～1.3倍[10]，其比例控制对于酿酒师来说具有非凡的挑战性。葡萄中的酒石酸不像苹果酸那样能通过呼吸作用被葡萄浆果细胞代谢，在整个成熟过程中保持相对稳定，而成熟期酒石酸浓度的下降主要是由于果实体积的增大产生的稀释作用造成[11]。浆果发育早期，酒石酸能够快速合成四碳有机酸，在酒精发酵过程中会与其他酸发生代谢反应，或者生成新的有机酸，帮助有机酸与盐平衡充当有效缓冲剂，酒石酸赋予葡萄酒独特风味和较低pH值，在酿酒过程中既对微生物有抑制作用，同时又能平衡味觉上的酸甜感以及视觉的色泽美感[12]。

1.2 苹果酸

苹果酸（Malic acid，MA）的分子式为C4H6O5，包含3种异构体，植物中通常以L-苹果酸的形式存在。葡萄果实中的苹果酸受生理环境因素影响较酒石酸大，稳定性较酒石酸差。相关研究表明，浆果成熟阶段温度越高，苹果酸含量越低，而成熟阶段的高温对酒石酸影响较小[13-15]。苹果酸味感尖酸生硬，但与柠檬酸相比酸度更低，酸感圆润，对味蕾的刺激渐缓，回味悠长持久，若将苹果酸与柠檬酸二者混合，不仅能削弱柠檬酸的尖锐感，而且可增加苹果酸的味蕾兴奋感，二者差异互补，呈现出浑厚强烈的天然果实风味。但高含量的苹果酸会使葡萄酒带有突出的酸涩感，类似于未成熟的苹果味道[16]，甚至可能引发葡萄酒瓶内发酵，使葡萄酒的品质下降甚至酸败。

1.3 柠檬酸

柠檬酸（Citric acid，CA）分子式为C6H8O7，无异构体，在葡萄的各个发育阶段柠檬酸都是葡萄果实中常见的有机酸组分，但葡萄中柠檬酸的含量仅占总酸的0.02%～0.03%[17]。柠檬酸的酸味朦胧新鲜，可与其他有机酸互补平衡葡萄酒的糖酸比，使葡萄酒清新爽口，它在葡萄浆果细胞代谢、细菌和酵母的生化过程中起着关键作用。

1.4 葡萄果实中有机酸的含量和组成

葡萄有机酸含量随果实的生长发育而变化，在葡萄整个生长发育过程中，酒石酸和苹果酸含量变化总趋势一致，即都呈先升高后降低的趋势[18-19]。崔婧等[20]对同一产地不同葡萄品种各发育阶段的有机酸进行变化分析，结果显示各品种间有机酸含量变化类似，即酒石酸含量在转色期达到峰值，苹果酸在转色期之前逐渐积累，转入成熟期后迅速下降，且下降速度比酒石酸大。裴英豪等[21]对‘赤霞珠’葡萄的研究表明，酒石酸含量呈先上升后下降的趋势，盛花期后30 d果实酒石酸快速积累，直至转色期时转而下降，葡萄完全转色后酒石酸含量的变化规律不明显，所以葡萄果实中酒石酸主要在花后30 d至转色期这段时间累积。柠檬酸在整个果实发育阶段呈下降趋势，尤其是到成熟期时柠檬酸含量快速降低[22]。

同一果实不同部位以及同穗果实不同果粒之间的有机酸分布不均一，果皮中有机酸含量较多，而葡萄籽中有机酸含量相对较少[23]。研究发现，同一穗葡萄的果粒之间有机酸含量差异明显，小果粒酒石酸和苹果酸的含量分别为5.88～10.20 mg和0.82～1.79 mg，大果粒酒石酸和苹果酸的含量分别为8.29～17.90 mg和0.82～3.92 mg[24]，导致这一差异性原因可能与果实所处的微环境有关。

不同葡萄品种的酸度存在差异，尤其是酒石酸和苹果酸的比例差异很大，这与苹果酸和酒石酸合成代谢中碳的流向改变有关[25-26]。Aubert等[27]对产于法国的‘无核白鸡心’和‘玫瑰香’等6个鲜食葡萄品种的研究发现，果实中的酒石酸和苹果酸分别占总酸含量的66.15%～78.48%和23.08%～37.17%。成冰[28]等人的研究结果得出了更显著的差异，欧亚种‘白比诺’葡萄的酒石酸和苹果酸分别占总酸的54.63%和44.62%，而欧美杂交种‘巴柯’（Bacco Noir）的酒石酸含量仅占总酸的9.25%，苹果酸占比却达到了81.77%。

2 主要有机酸的生物合成

2.1 酒石酸的合成

2.1.1 酒石酸合成的两个阶段

抗坏血酸（Asc）是酒石酸合成的前体[29]，合成途径以Asc为桥梁前后衔接（图2）。葡萄酒石酸合成的前期阶段为葡萄Asc的合成，Asc含量在花后35～45 d快速积累，之后缓慢降低，直到花后60～65 d时又逐渐升高，完全成熟时达到最大值[30]。在植物细胞组织中已报道的Asc合成途径中，除人们熟知的L-半乳糖途径（L-galactose pathway）外，还包括6-磷酸葡萄糖在一系列酶水解、氧化作用下生成Asc的糖醛酸转变途径，D-半乳糖经L-半乳糖内酯等多个中间物质形成Asc的碳链倒位途径以及D-葡萄糖经中间物质D-葡萄糖醛酮和L-山梨糖醛酮生成Asc的邻酮醛糖途径等[31-33]，对这些途径的研究虽取得了一定进展，但其合成调控机制尚未完全明晰，还需进一步深入探究。Wheeler等[34]认为，L-半乳糖途径是植物Asc合成的主要途径，葡萄糖经过一系列反应转化成L-半乳糖，再通过L-半乳糖酸脱氢酶（GaIDH)和L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶（GaILDH）的催化生成Asc[35]（图2）。而且高光胁迫能够提高该途径中L-半乳糖磷酸化酶（GGP）基因的表达量[36]，现已证实光照是酒石酸合成的必要前提，其稳定性较苹果酸强，充分的阳光照射有利于果实中的酒石酸含量达到最高水平[37]，这也说明L-半乳糖途径在酒石酸的合成过程中起着重要作用。植物Asc多集中于果实和叶片，高等植物Asc的合成途径会因植物果实生长发育进程而有差异[38]。在葡萄中，L-半乳糖途径负责幼果Asc积累，成熟浆果中Asc积累主要与D-半乳糖醛酸途径有关[39]，因此，果实的Asc水平可能由多种途径交叉控制。

图2 葡萄有机酸合成途径Figure 2 Grape organic acid synthesis pathway

葡萄酒石酸合成的后期阶段是葡萄Asc合成酒石酸的过程，Asc在C4/C5位点裂解，随后通过一个或几个未明确的反应步骤转化为2-酮-L-古洛糖酸，之后经还原和氧化生成L-艾杜糖酸和5-酮-D-葡萄糖酸，再经过一个未知酶将这个6碳化合物裂解成4碳中间体。该4碳中间体可能是酒石酸半醛，最后经氧化生成酒石酸[40]，关于酒石酸合成的相关酶尚不确定，需进一步验证。

2.1.2 L-半乳糖途径的相关酶及其基因

葡萄Asc的合成阶段，可以通过L-半乳糖途径中关键酶基因来调节植物Asc的含量，虽然在其他植物中有很多关于L-半乳糖途径关键酶基因的报道，但在葡萄中少见。该途径中的GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMP，VTC1）和GDP-D-甘露糖-3',5'-差向异构酶（GME）不仅参与Asc的合成，而且还参与蛋白质糖基化进行糖蛋白的合成以及细胞壁的多糖合成[41]，其编码基因已在多个植物中得到克隆和功能验证。Botella等[42]研究发现，GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因（VvGMPase）在葡萄叶片中高表达，而且在果实发育成熟过程中VvGMPase的表达量保持在相同水平。GME位于GMP下游，被认为是Asc生物合成的中心酶，它可以根据细胞的氧化还原状态和应激条件控制Asc合成的碳通量[43]。GME对于植物Asc的积累以及细胞壁的生物合成具有重要意义，该酶的功能作用在众多高等植物中已证实[44]。葡萄果肉中GME基因的mRNA水平始终低于整个浆果，GME基因主要集中在葡萄绿果期表达，在其他发育阶段表达下调，该基因编码的酶在L-半乳糖途径的控制中发挥重要作用[45-46]。

通过调控GGP基因的表达能够提高植物Asc含量。Bulley等[47]运用农杆菌介导转化技术将猕猴桃GGP基因转入到番茄、草莓、拟南芥等多个植物中，发现该基因的过表达使不同番茄品种的Asc含量增加了3～6倍，所有草莓品种的Asc含量都增加了2倍，转入拟南芥后Asc含量提高了4倍。Wang等[48]也报道了番茄GGP基因在烟草中的过表达使Asc含量显著增加。由此推测，GGP可能是植物Asc生物合成的关键限速酶，GGP基因可能是Asc合成途径中的关键调控基因。

GaILDH以细胞色素C作为特定的电子受体，是L-半乳糖途径合成Asc的最后一个酶，其活性和转录水平直接决定了Asc含量，对L-半乳糖-1,4-内酯具有高度特异性，能够迅速将外源性L-半乳糖-1,4-内酯转化为Asc[49]。VvGaILDH的表达量在葡萄成熟过程中不断增加，且在葡萄果肉和整个浆果中的表达水平近似[42]。植物果实Asc含量的增加可以通过增加GaILDH的表达来实现，该现象在苹果[50]、草莓[51]中都已证实。另外，L-GaILDH基因沉默也会影响番茄中Asc含量和果实发育[52]，这些事实表明L-GaILDH在Asc生物合成中起着关键作用。

在上述的相关酶中，GME、GGP和GaILDH被普遍认为是L-半乳糖途径的三个关键调控酶[53]。编码GME、GMP、GaILDH和GGP的基因表达水平与果实发育过程中Asc含量显著正相关，表明这些参与Asc生物合成的基因协同调控果实中Asc的积累。

2.1.3 酒石酸合成后期阶段的相关酶及其基因

关于Asc在C4/C5位点裂解成酒石酸中间产物的研究结论在20多年前就已被确定[54-55]，但有关葡萄酒石酸生物合成途径中起作用的酶及其基因则知之甚少，尤其是葡萄酒石酸合成途径中转酮醇酶和酒石酸半醛脱氢酶的功能尚不明确。综合前人研究结果推测，从Asc到酒石酸主要由2-酮-L-古洛糖酸还原酶（2-KGR）、L-艾杜糖酸脱氢酶（L-IDH）、转酮醇酶（TK）以及酒石酸半醛脱氢酶（TSDH）催化完成（图2）。其中，L-艾杜糖酸氧化为5-酮-D-葡萄糖酸是该途径中的限速步骤，L-IDH是该步骤的关键限速酶[56]。研究表明，酒石酸合成途径中的关键限速酶L-IDH在开花后35 d大量积累，随后迅速下降并维持在一定水平，L-IDH调控着酒石酸的生物合成，成熟浆果酸度的下降与编码L-IDH的基因下调相关[57]。在葡萄中已发现3个L-IDH基因，它们都位于16号染色体上，但只有VvLIDH3基因被证实能氧化L-艾杜糖酸，而VvLIDH1和VvLIDH3转录本均在幼果期优先表达，这可能与某些品种的季节性相关[58]。

虽然在多项研究中已证实L-IDH是目前酒石酸合成途径中明确的关键酶，但Cholet等[59]认为酒石酸合成途径中的关键酶可能不止L-IDH，它也可能与其他相关酶协同发挥作用。

Jia等[60]从葡萄属中初步鉴定了醛酮还原酶Vv2KGR具有2-KGR活性，该酶对乙醛酸具有高效催化作用，Vv2KGR在1.58A分辨率下的X射线晶体结构也表明，2-KGR与Vv2KGR结合的预测自由能最低，以此判断Vv2KGR参与了酒石酸的生物合成。但对2-KGR酶活性的体外研究表明，2-KGR具有广泛的底物活性，2-KGR可能还参与L-酒石酸之外的其他氧化还原反应[61]。然而酒石酸下游合成途径（TK将5-酮-D-葡萄糖酸转化成TSDH，再经过TSDH催化最终生成酒石酸）的研究甚少。在人类的基因组中，目前已经鉴定出了一个转酮酶（TKT）和两个TK相似基因，分别是TKTL1和TKTL2[62]。靳静晨等[63]根据烟草转酮醇酶基因序列设计引物，通过RT-PCR克隆了珊西烟的TK，并将其命名为NtTK，该基因全长2235 bp，编码744个氨基酸，与已报道的烟草TK基因核酸序列同源性达99%。

酒石酸的初级代谢虽有一定突破，但关于调控酒石酸合成代谢的关键结构基因和转录因子的研究仍然任重道远，因此系统深入地探究酒石酸生物合成的调控机制，能够为今后生产过程中有目的地控制葡萄酒石酸的含量提供相应的理论依据。

2.2 葡萄苹果酸以及柠檬酸的生物合成

TCA循环是植物苹果酸、柠檬酸、草酰乙酸等有机酸合成的重要途径，该途径将各有机酸之间紧密联系。植物果实中的苹果酸可以通过植物的根、叶转运输送以及果实本身的光合作用进行合成，参与众多细胞功能。苹果酸从液泡中释放出来，再通过各种途径进行分解代谢，包括TCA循环、糖异生、氨基酸转化、乙醇发酵以及复杂的次级化合物的合成[64-65]。葡萄中的苹果酸是由糖酵解的终产物丙酮酸进入TCA循环转化而来[66]，而柠檬酸的合成起源于磷酸烯醇式丙酮酸，经磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和苹果酸脱氢酶（MDH）催化获得草酰乙酸（OAA）和苹果酸，OAA和苹果酸经TCA循环获得柠檬酸[67]。

长期以来，在果实苹果酸和柠檬酸合成代谢途径中的酶及编码基因都备受关注，其中PEPC、MDH和CS是苹果酸和柠檬酸合成代谢的3个关键酶[68]。苹果酸在葡萄浆果中的持续积累主要是由于PEPC与MDH的联合驱动，PEPC是一类常见的胞质酶，在植物碳代谢、果实有机酸运输方面发挥重要作用[69]，从目前对PEPC基因的研究中能够看到PEPC在葡萄[70]、玉米[71]等相关植物中都有鉴定。Sun等[72]从NCBI数据库中下载了与有机酸生物合成途径有关的基因，将这些序列用于葡萄果实同源基因的寻找，在葡萄果实中鉴定出2个PEPC编码基因和2个MDH编码基因。PEPC在葡萄果实不同发育阶段具有表达差异性，浆果发育早期PEPC积累较高，直到成熟后期PEPC积累有所下降[73]，这表明PEPC调节控制整个浆果发育过程中苹果酸合成与代谢。MDH在线粒体中催化苹果酸发生氧化反应促进OAA生成，同时也可以将OAA转化成苹果酸完成TCA循环，MDH基因在葡萄[74]、竹科[75]等植物中均已得到相关鉴定。MDH在葡萄成熟过程中表达，苹果酸浓度的降低与其编码基因表达的减少有关，同时，高温对MDH表达具有抑制作用[76]。柠檬酸不仅作为线粒体内TCA循环的底物，而且还是线粒体外辅助乙酰辅酶A合成的乙酰供体，CS是柠檬酸代谢的关键酶，其研究主要集中在水果的生长和发育上[77]，在甜橙[78]、梅[79]等果实中报道CS对柠檬酸的合成具有积极作用，CS基因表达与果实中柠檬酸含量呈正相关。但对‘赤霞珠’果实研究发现，CS与柠檬酸的含量无关，这可能是‘赤霞珠’果实中有机酸代谢与梅、甜橙等核果类不同所致[80]。

3 展望

有机酸是衡量葡萄品质的重要参数，葡萄有机酸合成、代谢和调控机制的研究在葡萄种植和酿造方面具有重要的理论和实际意义。综合上述内容对酿酒葡萄有机酸的研究提出以下展望：

（1）酒石酸受环境因素影响较苹果酸小，热敏性低于苹果酸，在葡萄成熟过程中相对稳定，作为葡萄的特征酸，酒石酸在葡萄品质评价等方面有着举足轻重的作用。目前苹果酸和柠檬酸合成代谢途径的研究相对成熟，但是酒石酸的合成代谢途径存在诸多疑问。因此，酒石酸应作为葡萄有机酸研究的重点。

（2）酒石酸合成前期阶段的关键酶及结构基因已有明确报道，但关于Asc合成酒石酸阶段的关键酶还存在诸多争议，例如，L-IDH是否为Asc合成酒石酸阶段的唯一关键酶？Asc在转化为2-酮-L-古洛糖酸的过程中经过了怎样的反应步骤？除已明确的2个酶L-IDH和2-KGR参与了葡萄酒石酸合成外，如何明确转酮醇酶和酒石酸半醛脱氢酶参与葡萄酒石酸的合成？这些方面仍需深入研究酒石酸后期合成阶段的合成途径。

（3）葡萄有机酸合成代谢途径中涉及的基因众多，一方面相关的结构基因功能需要进一步验证，另一方面应深入挖掘转录调控因子并进行功能验证，以期实现葡萄有机酸含量和组成的精准调控。

（4）目前葡萄有机酸的研究主要集中于合成调控方面，而有机酸合成后的下游代谢途径也需要深入研究，尤其是对酒石酸的研究，从而明确有机酸含量随浆果成熟下降的多种原因。