HSF1在皮肤鳞状细胞癌中的表达及意义*

程丽芳 夏碧霞 何萍秀 吴忆

皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）是起源于表皮形成细胞的恶性增殖，大多数发生在老年患者的曝光部位，是人类第二常见的癌症，它的发病率还在持续上升[1]。由于其局部侵袭性强，复发、转移的风险较高，对老年患者的生活质量产生较大影响，而老年人特别是高龄老人全身情况较差，难以支持长时间手术，因此需要对cSCC 的分期和预后做早期诊断并需要除手术切除之外的多种方法治疗[2]。热休克转录因子1（heat shock factor 1，HSF1）是一组普遍存在于真核生物细胞中调节热休克反应的转录因子，它的激活与肿瘤的起始、生长、侵袭和转移广泛相关，已被证明是肿瘤启动子和潜在的诊断标志物[3]，并与患者的预后有很强的相关性[4]。目前有HSF1 和乳腺癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌等多种癌症相关的研究报道，HSF1 在癌组织中的阳性表达率明显高于对照组织，但尚无与皮肤鳞状细胞癌的相关的研究[5-6]。本研究旨在通过检测HSF1 在cSCC 中的表达来探索其与cSCC 分化和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017 年12 月-2021 年6 月江西省皮肤病专科医院病理科确诊为cSCC 的42 例患者的癌组织标本蜡块（高中低分化的比例为1∶1∶1，其中有转移性cSCC 8 例），取该患者的癌旁组织标本作为对照；选取3 年内发生复发的10 例cSCC 患者的标本蜡块为复发组（高中低分化的比例为5∶4∶1）和随访3 年未发生复发的20 例cSCC 患者的标本蜡块为未复发组（高中低分化的比例为5∶4∶1）。诊断标准参照《中国临床皮肤病学》。纳入标准：（1）资料完整且经两位病理科医师双盲法阅片同时确诊为cSCC；（2）有充足的组织供研究。排除标准：术前未经放疗、化疗或免疫疗法。纳入的42 例cSCC 患者中，男21例，女21 例；年龄44～96岁，平均（74.95±11.69）岁；分化程度：高分化14例，中分化14例，低分化14 例。本研究已经本院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 一抗（兔抗人HSF1 多克隆抗体BA1637）购自武汉博士德生物工程有限公司。二抗（HPR 标记鼠/兔通用型二抗）、柠檬酸抗原修复液购自福州迈新生物科技有限公司。PBS 缓冲液、DAB 显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 采用免疫组化EnVision 法染色 把切成4 μm的石蜡切片脱蜡水洗；滴加3% H2O2内源性过氧化物酶阻断剂作用8 min，PBS 水洗3 次（每次3 min）；柠檬酸修复液放置高压锅中加热煮沸后取出，将切片置于其中直至冷却，取出放置孵育盒中，滴加一抗（浓度为1∶400），放置4 ℃冰箱过夜；第二天取出用PBS 水洗3 次（每次3 min）；滴加二抗放置37 ℃水浴箱中孵育16 min，PBS 水洗3 次（每次 3 min）；DAB 显色，时间1～3 min；蒸馏水冲洗；苏木素复染10 s，盐酸酒精分化2 s，自来水冲洗返蓝，脱水（75%酒精、85%酒精、95%酒精，无水酒精水；二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3 各10 s）；中性树胶封片。光镜下观察。

1.3 观察指标及评价标准 分析HSF1 在cSCC 中的表达情况。分析HSF1 在cSCC 中的表达与临床病理参数的关系。分析HSF1 在复发和未复发cSCC组织中的表达。结果判读：HSF1 阳性表达为细胞核呈现棕黄色颗粒。由两位资深病理医师采用双盲法进行判读。染色强度打分：0 分未着色；1 分浅黄色，略高于背景；2 分棕黄色，明显高于背景；3 分棕褐色。每张切片随机选取5 个高倍镜视野计数阳性细胞百分比：无阳性细胞为0分，≤25%为1 分；26%～50%为2 分；51%～70%为3 分；＞70%为4 分。将以上两项结果的乘积分为4 级：0～2 分为阴性（-）；3、4 分为弱阳性（+）；5～8 分为阳性（++）；9～12 分为强阳性（+++）。其中阴性（-）和弱阳性（+）判定为低表达即阴性表达，阳性（++）和强阳性（+++）判定为高表达即阳性表达。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0 软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，行Pearsonχ2检验和连续性校正χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSF1 在cSCC 组织中的表达 HSF1 阳性表达部位主要在细胞核，见图1。cSCC 组织HSF1 表达阳性率为61.90%（26/42），高于对照组癌旁组织的0，差异有统计学意义（χ2=37.655，P=0.000），见表1。

表1 HSF1在cSCC组织和癌旁组织表达[例（%）]

图1 HSF1在cSCC中的表达情况

2.2 HSF1 在cSCC 中的表达与临床病理参数的关系 不同性别、年龄、皮损部位的cSCC 患者的HSF1阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。肿瘤最大直径＞2 cm 患者的HSF1 阳性表达率高于肿瘤最大直径≤2 cm 患者（P＜0.05）。不同分化程度cSCC 患者的HSF1 阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。发生转移的cSCC 患者的HSF1阳性表达率高于未发生转移患者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 HSF1表达与cSCC临床病理参数的关系[例（%）]

2.3 HSF1 在复发和未复发的cSCC 患者中的表达 复发和未复发cSCC 患者的HSF1 阳性表达率比较，差异无统计学意义（χ2=0.017，P=0.897），见表3。

表3 HSF1在复发和未复发cSCC患者中表达[例（%）]

3 讨论

恶性转化伴随着调节发育、代谢、增殖、运动及抗压能力的关键细胞通路的改变，热休克因子（HSFs）作为一种转录因子，已被证明在所有这些生物过程中发挥重要作用[7]。癌细胞长期暴露在各种压力下，如缺氧和营养缺乏、免疫反应、代谢失调和基因组不稳定等，都会导致HSF1 的激活[8]。HSF1已被证明在许多癌细胞系、自发性肿瘤发生小鼠模型和移植瘤中促进癌症的起始、维持和进展[9-10]。

越来越多的研究发现，HSF1 在多种肿瘤中过表达，在肿瘤发生和发展中发挥着关键作用[11-13]。遗传毒性、氧化应激、炎症和代谢等各种环境应激原可诱导HSF1 过度激活和升高，进而诱导肿瘤细胞的生长、侵袭和转移[14]。目前已证实的HSF1 对肿瘤的作用及机制包括：（1）通过提高热休克蛋白27（HSP27）、热休克蛋白70（HSP70）和热休克蛋白90（HSP90）的水平，调控Bag-3 辅助伴侣分子的表达和负调控促凋亡的X 连锁凋亡抑制蛋白相关因子-1（XAF1）而在肿瘤细胞逃避程序性细胞死亡中起重要作用；（2）调节细胞周期进程和有丝分裂；（3）与细胞分裂周期蛋白20（CDC20）结合及阻断CDC20 和细胞分裂周期蛋白27（CDC27）的相互作用来诱导非整倍体形成，而非整倍体常与细胞分化降低和肿瘤恶性程度增加有关；（4）癌细胞中HSF1 水平的升高可以调节能量代谢，将葡萄糖利用转向糖酵解途径，同时，可调节脂质代谢，为肿瘤细胞的快速生长提供能量[15]；（5）调控和定义肿瘤起始细胞的表型；（6）改变局部组织环境以支持肿瘤发生，包括血管生成、侵袭或间质激活；（7）HSF1 作为不同信号通路的调节剂参与肿瘤的发生和发展，如HuR-HIF-1、Slug、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、核内转录因子κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）、PI3K-AKT-mTOR、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等通路[9]；（8）通过HSP 介导的下游效应或其他新的转录靶点参与肿瘤细胞的转移；（9）促进肿瘤的复发和耐药[16-17]；（10）HSF1 也以基因组的各种非编码区域为目标，HSF1 直接结合的非编码基因组位点，包括中心外卫星DNA 重复序列、（亚）端粒DNA 重复序列、短间杂核元件重复序列、转录活性增强子等[18]。

HSF1 的激活受细胞内多种分子和信号通路的调控，HSF1 的激活和衰减构成了一个维持细胞蛋白质稳定的复杂循环，至少包括以下六个步骤：去抑制、三聚体化、核易位、DNA 结合、转录激活和调节HSF1 的稳定性。大多数调控发生在翻译后修饰水平，包括磷酸化、乙酰化、类泛素化和泛素化。除了转录后修饰的调控外，HSF1 还可被上游转录因子核呼吸因子2（nuclearrespiratoty factor 2，NRF2）、转录因子Ying-Yang1（YY1）和转录激活因子3（activating transcription factor 3，ATF3）上调。致癌基因Notch1 能够劫持细胞的应激系统，引发HSF1 的表达。MiR-644a 可通过调节HSF1 mRNA的稳定性下调HSF1 的表达[19]。

由于HSF1 的高表达与疾病的恶化相关，且HSF1 在肿瘤的起始、促进和进展中的作用。HSF1可能成为人类癌症的潜在治疗靶点及判断预后的生物标志物，同时用来评估癌症患者的预后。一些临床前研究揭示了小分子HSF1 抑制剂的抗肿瘤活性[20]。同时，HSF1 基因消融在正常细胞和动物基础生理条件下具有良好的耐受性。HSF1 对正常细胞和恶性细胞依赖性的差异可以作为一种有效的癌症治疗策略。尽管目前可用的热休克转录因子（HSF）抑制剂缺乏特异性，但对HSF1 调控不断加深了解，加上药物发现的进展，将有助于开发更有效和更特异的HSF1 抑制剂。随着对HSF1 活化和衰减复杂机制的认识不断扩大及新技术的发展，更特异的靶向、更强效和更有选择性的HSF1 抑制剂可能在未来几年被开发出来[21]。

影响cSCC 预后的因素众多[22]，本试验探讨了HSF1 在cSCC 中的表达，与临床病理特征的关系及和cSCC 术后复发的关系，提示HSF1 的阳性表达与cSCC 的肿瘤最大直径、分化程度、侵袭性转移相关，推断其在肿瘤的发生、发展中发挥一定作用，可为cSCC 的诊疗提供理论参考，为肿瘤的预后提供证据。HSF1 表达与肿瘤术后的复发无明显相关性，肿瘤术后复发原因复杂。

同时，因HSF1 是cSCC 发展的重要参与者，本研究下一步将增加样本量并进行分子机制的探讨和研究，为cSCC 相关靶向药物的研发提供更坚实的理论基础，为老年cSCC 患者的治疗提供更多选择。