血清SIRT1表达对丙戊酸钠治疗癫痫患者疗效的影响 Δ

杨艳萍 ，何蝶 ，周振 ， ，曾庆繁 ，彭红英 ，赵立新 ，马丹 （.贵州医科大学附属白云医院药剂科，贵阳 00；.贵州医科大学附属医院药剂科，贵阳 000；.贵州医科大学附属白云医院麻醉科，贵阳 00；.贵州医科大学附属白云医院肾内科，贵阳 00；.贵州医科大学附属白云医院中医科，贵阳 00；.贵州医科大学附属医院血液内科，贵阳 000）

癫痫是一种常见的神经系统疾病，全球约5 000万人患有癫痫，其发病率在神经科疾病中仅次于头痛，临床上治疗较为困难，且很难根治[1―4]。丙戊酸钠（sodium valproate，VPA）已被广泛用于癫痫的长期治疗[5]，主要作用机制是阻断持续和快速的钠电流，限制神经元高频重复放电[3，6]。VPA用于癫痫失神发作、临床抑郁症、强直-阵挛性癫痫、青少年肌阵挛性癫痫和复杂部分性癫痫的临床疗效较好[7―8]。在临床实践中发现，部分癫痫患者VPA血药浓度虽然在有效范围内，但无临床疗效，其原因尚未明确。

有研究发现，持续的癫痫发作会导致线粒体功能障碍，这可能是癫痫发作引起脑损伤的关键因素[9]。Sirtuin-1（SIRT1）是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激活的去乙酰化酶，可参与衰老、能量代谢、炎症和肿瘤等多种生理病理过程[10]。SIRT1在癫痫状态下能发挥内源性神经保护作用，抵消癫痫持续状态后癫痫发作诱导的神经元细胞损伤，并在癫痫持续状态下增强大鼠海马体中的表达和活性[11―12]。有研究表明，SIRT1对细胞内的代谢应激信号敏感，在癫痫发生早期迅速上调，且癫痫患者和动物脑组织中的SIRT1表达和活性增加与难治性癫痫发生密切相关[13―14]。因此，SIRT1的高表达可能导致药物控制癫痫发作效果不佳。VPA治疗癫痫的有效血药浓度为50～100 μg/mL，VPA＜50 μg/mL视为无效浓度，VPA＞100 μg/mL视为中毒浓度[15]，而SIRT1高表达癫痫患者的VPA血药浓度的有效范围有待研究。有研究表明，人脑组织中的SIRT1和血清中的SIRT1表达相关联[16]。因此，本研究探讨了血清SIRT1表达对VPA治疗癫痫患者疗效的影响，以期为临床合理用药提供参考。

1 材料与资料

1.1 主要仪器与试剂

DA-1型干式荧光免疫分析仪、FY-06型试剂卡孵育器、VPA检测试剂盒（批号FFS092T）均购自北京丹大生物技术有限公司；Research®plus型手动移液器、吸头及离心管均购自德国Eppendorf公司；Pico17型高速离心机购自美国Thermo Fisher Scientific公司；WiseMix VM-10型涡旋振荡器购自韩国Daihan公司；BIOG RNA提取试剂盒（批号202011Q610001）购自常州百代生物科技股份有限公司；全自动生化分析仪购自瑞士Roche公司。主要试剂包括无水乙醇、异丙醇、氯仿、无酶无菌水等。

1.2 临床资料

选择2021年3－10月贵州医科大学附属白云医院（以下简称“我院”）就诊、出院后单独口服VPA治疗的54例癫痫患者（包括有过癫痫史或有明确癫痫诱因的癫痫患者）为研究对象，患者年龄19～88岁，男42例、女12例。另同期选择我院体检中心50例体检健康者作为基线参考样本，年龄18～89岁，男31例、女19例。本研究的纳入标准为：（1）年龄≥18岁；（2）入院诊断为癫痫，诊断标准参考《临床诊疗指南·癫痫病分册（2015修订版）》[5]；（3）出院后单独口服VPA。本研究的排除标准为：（1）伴有其他恶性疾病者，如恶性肿瘤、白血病；（2）肝功能不全者；（3）同时服用其他抗癫痫药物或采用其他手段治疗癫痫者。本研究方案已获得我院医学伦理委员会审核批准，批件号：2022伦审第（8）号。所有患者均知情同意，并签署了知情同意书。

2 方法

2.1 血清RNA的提取

试验前准备BIOG RNA提取试剂盒中的洗涤液A和洗涤液B。取血清样本和RNA载体置于无RNA酶的EP管中混匀，加入裂解液和消化液混合均匀，然后于56 ℃水浴10 min至完全裂解，再加入无水乙醇，混匀。将吸附柱置于收集管中，取上述溶液转入吸附柱内，静置2 min，以12 000 r/min 4 ℃离心1 min（下同），弃收集管内废液。剩余溶液转移至吸附柱内，静置2 min，离心，弃收集管内废液。吸附柱放回收集管内，加洗涤液A至吸附柱内，离心，弃收集管内废液。吸附柱放回收集管内，加洗涤液B至吸附柱内，离心，弃收集管内废液。将吸附柱放回收集管内，离心，弃残留的洗涤液。取出吸附柱，放入新的无RNA酶的离心管内，再加入洗脱液，静置3 min，离心，收集RNA溶液，于－80 ℃冰箱保存，待检测。

2.2 血清SIRT1 mRNA相对表达水平的检测

采用实时荧光定量PCR检测。提取血清RNA后，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，反应后分析基因扩增的循环阈值（Ct值）。SIRT1引物序列（5′→3′）：上游引物TGATTGGCACAGATCCTCGAA，下游引物AAGTCTACAGCAAGGCGAGC；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物序列（5′→3′）：上游引物TGTGTCCGTCGTGGATCTGA，下游引物CCTGCTTCACCACCTTCTTGA。实时荧光定量PCR反应条件：95 ℃ 3 min预变性，然后按95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40次循环。以GAPDH为内参，以2－ΔΔCt计算SIRT1 mRNA的相对表达水平。

2.3 分组与给药

以SIRT1 mRNA相对表达水平低于基线的癫痫患者作为SIRT1低表达治疗组，高于基线的癫痫患者作为SIRT1高表达治疗组。

根据患者实际使用药品情况，本研究中患者使用的VPA包括本院开具的和患者院外自带药品，经统计分别来自湖南省湘中制药有限公司（本院药品）、山东方明药业股份有限公司（院外自带）、山东仁和制药有限公司（院外自带）。通过查阅有关文献，上述3种VPA均符合一致性评价，临床疗效无明显差异[17]。根据药品说明书内容，3种VPA的用药方案一致。因此本研究的给药方案为：SIRT1低、高表达组患者出院后，参照药品说明书，口服低剂量VPA（12 mg/kg或每日约600 mg）治疗，用药后分别作为SIRT1低表达治疗组和SIRT1高表达治疗组；并于用药1周后监测两组患者的血药浓度，调整VPA血药浓度在有效范围内。治疗3个月后，所有患者回院复查VPA血药浓度，评价治疗3个月的临床疗效（临床疗效评价标准见“2.5”项下）。若患者临床疗效为无效，则增加VPA剂量至15 mg/kg或每日约800 mg，此部分患者作为SIRT1低表达加量组和SIRT1高表达加量组。继续治疗3个月后，加量组患者回院复查VPA血药浓度，评价其增加剂量治疗3个月的临床疗效。

2.4 血药浓度检测

患者出院后对口服低剂量VPA治疗3个月、治疗3个月后癫痫控制无效增加药物剂量再治疗3个月的癫痫患者进行血药浓度检测。患者出院后，口服VPA，每3个月复查1次，血液样本采集后，于室温条件下24 h内完成检测；若样本在24 h内不能及时检测，其在4 ℃冷藏保存不可超过7 d，－20 ℃以下冷冻保存不可超过1个月；样本检测前需要恢复至室温，冷冻保存的样本需要完全融化、复温、混合均匀后使用（切忌反复冻融）。采用干式荧光免疫分析仪监测患者的血药浓度。血液样本离心后，取10 μL血清，加入VPA检测试剂盒充分混匀得稀释液，取80 μL稀释液加入试剂卡中孵育15 min，检测血药浓度。VPA检测结果的参考区间参考文献[15]。

2.5 临床疗效评价

患者出院后对口服低剂量VPA治疗3个月、治疗3个月后癫痫控制无效增加药物剂量再治疗3个月的癫痫患者进行临床疗效评价。3个月内癫痫完全控制或发作次数减少＞75%视为显效，发作次数减少50%～75%视为有效，发作次数减少25%～＜50%视为疗效差，发作次数减少＜25%或发作加重视为无效[18]。有效控制率（%）＝（显效例数+有效例数）/总例数×100%，无效控制率（%）＝（疗效差例数+无效例数）/总例数×100%。总有效控制率（%）＝[（显效例数+有效例数）治疗组+（显效例数+有效例数）加量组]/总例数×100%。

2.6 肝功能指标检测

采用全自动生化分析仪检测治疗前、口服低剂量VPA治疗3个月、治疗3个月后癫痫控制无效增加药物剂量再治疗3个月的癫痫患者的肝功能。丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的参考范围为 10.00～35.00 U/L，天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）的参考范围为8.00～40.00 U/L，总胆红素（total bilirubin，TBIL）的参考范围为1.70～21.00 μmol/L。

2.7 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。计量资料以±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 癫痫患者治疗前SIRT1 mRNA相对表达水平检测结果

治疗前，54例患者中有31例患者的SIRT1 mRNA相对表达水平低于基线值，有23例患者高于基线值。与健康者SIRT1表达组相比，SIRT1低表达治疗组治疗前SIRT1 mRNA相对表达水平显著降低，SIRT1高表达治疗组显著增加，结果见图1。

图1 癫痫患者治疗前SIRT1 mRNA相对表达水平比较（±s）

3.2 SIRT1高、低表达癫痫患者治疗后各时间点血药浓度监测结果

低剂量VPA治疗3个月、治疗3个月后癫痫控制无效增加药物剂量再治疗3个月后，全部患者的血药浓度均在50～100 μg/mL之间，表明血药浓度始终在有效浓度范围内。其中，低剂量VPA治疗3个月后的血药浓度检测结果显示，SIRT1低表达治疗组与SIRT1高表达治疗组患者的血药浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗3个月后癫痫控制无效增加药物剂量再治疗3个月的血药浓度检测结果显示，SIRT1高表达加量组患者的血药浓度平均值为（84.15±4.24） μg/mL，显著高于 SIRT1高表达治疗组（64.40±3.40） μg/mL（P＜0.05）。结果见图2。

图2 SIRT1高、低表达癫痫患者治疗后各时间点血药浓度监测结果比较（±s）

3.3 SIRT1高、低表达癫痫患者治疗后各时间点临床疗效评价结果

在VPA有效血药浓度范围内，癫痫患者给予低剂量VPA治疗3个月后，31例SIRT1低表达治疗组患者中有26得到有效控制，5例控制无效；23例SIRT1高表达治疗组患者有10例得到有效控制，13例控制无效，SIRT1高表达治疗组患者癫痫有效控制率明显低于SIRT1低表达治疗组（P＜0.05）。治疗3个月后癫痫控制无效的患者增加药物剂量再治疗3个月，其中5例SIRT1低表达加量组患者有3例被有效控制，13例SIRT1高表达加量组患者有9例被有效控制，SIRT1高表达加量组患者癫痫有效控制率显著高于SIRT1高表达治疗组（P＜0.05）。治疗6个月后，31例SIRT1低表达组患者最终有29例患者得到有效控制，23例SIRT1高表达组患者19例得到有效控制。结果见表1。

表1 SIRT1高、低表达癫痫患者治疗后各时间点临床疗效监测结果

3.4 SIRT1高、低表达癫痫患者治疗前后各时间点肝功能指标检测结果

对癫痫患者治疗前后各时间点的肝功能指标进行检测，结果见表2。如表2所示，随着血药浓度的增加，癫痫患者肝功能指标水平均在参考范围内。

表2 SIRT1高、低表达癫痫患者治疗前、后各时间点肝功能指标检测结果（±s）

表2 SIRT1高、低表达癫痫患者治疗前、后各时间点肝功能指标检测结果（±s）

组别SIRT1低表达组（治疗前）SIRT1低表达治疗组SIRT1低表达加量组SIRT1高表达组（治疗前）SIRT1高表达治疗组SIRT1高表达加量组n 31 31 5 23 23 10 ALT/（U/L）16.39±0.12 21.23±0.54 24.58±0.25 16.98±0.27 19.58±0.29 19.49±0.31 AST/（U/L）21.53±0.34 25.67±0.32 26.72±0.28 18.36±0.33 21.11±0.32 23.30±0.41 TBIL/（μmol/L）8.76±0.15 9.84±0.67 11.02±0.18 10.70±0.22 9.67±0.18 10.77±0.21

4 讨论

研究显示，VPA血药浓度在50～100 μg/mL范围内时，癫痫控制效果好，VPA＜50 μg/mL表明癫痫控制效果较差，VPA＞100 μg/mL将增加VPA的药物不良反应[15]。本研究以临床入院诊断为癫痫、出院后口服单药VPA的患者为研究对象，探讨了血清SIRT1表达对VPA治疗癫痫患者疗效的影响。结果显示，低剂量VPA治疗后，患者的血药浓度在最小有效浓度（50 μg/mL）之上，增加VPA剂量后，SIRT1高表达患者的血药浓度在80～100 μg/mL之间，也在VPA最小中毒浓度（100 μg/mL）之下。本研究同时监测了低剂量VPA治疗3个月、治疗3个月后癫痫控制无效增加药物剂量再治疗3个月的患者癫痫控制率，结果显示，在VPA血药浓度50～70 mg/L有效浓度范围内，与SIRT1低表达治疗组患者比较，SIRT1高表达治疗组患者的控制癫痫发作效果不佳；增加VPA剂量后，患者血药浓度在80～100 mg/L有效浓度范围内，与SIRT1高表达治疗组患者比较，SIRT1高表达加量组患者的控制癫痫发作效果更佳。

VPA是治疗癫痫的常用药物[19]，但由于该药的治疗窗较窄，个体化给药差异较大，以肝毒性尤为严重[20]，故在患者使用VPA期间，应密切监测其血药浓度，并定期进行肝功能指标检测，以降低药物不良反应的发生风险[21―22]。本研究对癫痫患者血药浓度和肝功能指标进行监测，结果表明，随着血药浓度增加，肝功能指标水平上升，虽差异无统计学意义，但考虑到癫痫是一种慢性、复发性和进行性神经系统疾病，需长期治疗，因此更应关注患者肝功能变化，对需终身服药患者建议增加保肝药物。

研究显示，SIRT1与癫痫发生存在密切联系，其中SIRT1的表达和活性上调可能在难治性癫痫发病机制中起重要作用[14]。大鼠癫痫持续状态下海马体中SIRT1的表达和活性增强[11]，因此推测癫痫患者在口服VPA治疗中，SIRT1的表达可能会影响VPA治疗癫痫的效果。尽管已知SIRT1通路可通过调节过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α参与线粒体生物发生[23―24]，但目前尚无关于SIRT1影响癫痫的报道。本研究结果表明，在常规VPA血药浓度范围内治疗癫痫时，与SIRT1低表达治疗组癫痫患者比较，SIRT1高表达治疗组患者控制癫痫发作效果不佳，推测SIRT1高表达很有可能与癫痫难治有关。

综上所述，在VPA有效血药浓度范围内治疗癫痫，血清SIRT1高表达患者的癫痫可能更难控制；增加VPA剂量后，可提高癫痫发作的有效控制率。本文为揭示SIRT1对癫痫发作和癫痫治疗的影响提供了一定的研究基础。由于癫痫是一个极其复杂的生理病理过程，且本文临床样本量较少，后期SIRT1低表达加量组临床样本量更少，组间比较存在一定的局限性，为更好地控制癫痫发作，本课题组下一步将增加临床样本量，探索SIRT1在癫痫中的作用机制。