外源赤霉素对缓解紫花苜蓿幼苗盐胁迫的作用研究*

朱 琨，刘骅峻，李 波

(1.齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省农业科学院 畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔 161005；3.黑龙江省扎龙国家级自然保护区管理局，黑龙江 齐齐哈尔 161002)

近年来，中国土地盐碱化面积不断增加，东北地区盐渍土面积约为7.66×106hm2，该地区土壤含盐量高，渗透性差，硬化严重，土壤致害盐类为NaCl、Na2SO4、Na2CO3和NaHCO3，其中NaCl 和Na2SO4含量多的称为盐土，而Na2CO3和NaHCO3含量多的称为碱土。大量盐分积累会使土壤中离子含量升高，严重制约当地农业的发展[1-2]。外源激素和植物耐盐性的研究引起了广泛关注，尤其是赤霉素(gibberellins，GA3)在作物抗盐性机理研究上的应用。GA3作为一种促进生长的植物激素，可调节植物种子萌发等多种生理活动，还能与植物体内的吲哚乙酸和乙烯协同促进植物生长，是植物生长发育过程中的必要激素。前人研究表明：通过施用微量外源GA3可诱导植物产生抗盐性[3]，对黄瓜(Cucumis sativusL.)[4]、水稻(Triticum aestivumL.)[5]和烟草(Nicotiana tabacum)[6]等多种植物的生长发育和抗逆境胁迫具有重要意义。在植物抵抗盐的过程中，施用外源GA3可有效缓解高盐环境对植物生长的抑制作用，减少盐对细胞膜的伤害、增强抗氧化保护酶系统活性和提高渗透调节物质含量[7-8]，从而提高植物的耐盐性，因此，GA3对植物生长和抵抗逆境有着重要的调控作用。

紫花苜蓿(Medicago sativaL.)为豆科(Leguminosae)苜蓿属(Medicago)多年生草本植物，富含蛋白质、微量元素和维生素等营养成分，抗逆境能力较强，生长迅速，已成为世界上最主要的饲料作物[9-10]。本研究以阿迪娜和龙牧801 紫花苜蓿为材料，探讨外源GA3对盐胁迫苜蓿幼苗的缓解效应，从生理和生化方面综合考察外源激素对盐胁迫的缓解作用，为利用外源激素缓解盐胁迫下苜蓿幼苗的生长提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以阿迪娜和龙牧801 紫花苜蓿种子为试验材料，种子由黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院提供。

1.2 试验方法

1.2.1 苜蓿幼苗培养

采用土培法将种子播种在花盆中(高14 cm，直径27 cm)，盆中针叶土、营养土和珍珠岩按体积比 1.0∶2.0∶0.5 混合，定期浇水，将幼苗培养至三叶一心期。

1.2.2 幼苗盐胁迫和激素处理

播种45 d 后，采用前期试验筛选的NaCl+Na2SO4混合盐(2 种盐浓度相同，体积比为1∶1)半致死浓度浇灌苜蓿幼苗，其中，阿迪娜幼苗浇灌200 mmol/L 混合盐溶液100 mL，龙牧801 幼苗浇灌150 mmol/L 混合盐溶液100 mL。每3 d浇1 次混合盐溶液，共处理3 次，每个处理3 次重复。以浇等量去离子水的幼苗为对照组(CK)，处理结束后取其功能叶片保存在-80 ℃超低温冰箱中备用。

为了获得有效的GA3浓度，向NaCl+Na2SO4混合盐胁迫的2 种苜蓿幼苗叶片喷施不同浓度的GA3(表1)，以喷施去离子水为对照组(CK)，每3 d 喷施1 次，共缓解2 次，第2 次缓解结束后3 d采集叶片保存在-80 ℃ 超低温冰箱中备用。

表1 混合盐浓度和GA3 质量浓度Tab.1 Concentration of mixed salt and mass concentration of GA3

1.2.3 幼苗生理生化指标的测定

渗透调节物质的测定：可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮法测定；甜菜碱含量采用雷氏盐法测定[11]。

保护酶活性的测定：过氧化物酶(peroxidase，POD)活性采用愈创木酚比色法测定；过氧化氢酶(catalase，CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonialyase，PAL)活性采用分光光度法测定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性采用NBT 光化还原法测定[12]。

1.2.4 苜蓿幼苗盐胁迫缓解效应的综合评价

采用隶属函数法对各处理2 个苜蓿品种幼苗各项耐盐指标的隶属值进行累加，取平均值，并据此对2 个苜蓿品种进行综合评价。计算公式为：U(Xij)=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)。式中：U(Xij)为某品种第i个处理组j项指标的隶属值，Xmin和Xmax分别为j项指标的最小值和最大值。

1.2.5 数据处理与分析

采用 Excel 2020 对数据进行统计，采用 SPSS 21.0 进行显著性分析，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 GA3 对混合盐胁迫下苜蓿幼苗叶片渗透调节物质的影响

由图1 可知：外源GA3缓解NaCl+Na2SO4混合盐胁迫时，随着GA3质量浓度的增加，可溶性蛋白、脯氨酸、可溶性糖和甜菜碱含量均呈先升高后降低的变化趋势。各缓解组的可溶性糖和甜菜碱含量均高于CK 组和混合盐胁迫组 (A组)，脯氨酸含量均高于CK 组；除60 mg/L GA3处理组外，其他缓解组的可溶性蛋白含量均高于A 组而低于CK 组。可见，施加一定质量浓度GA3可积累渗透调节物质，以缓解混合盐对苜蓿幼苗的胁迫。进一步分析苜蓿叶片渗透调节物质积累变化可知：60 或90 mg/L GA3处理下积累的渗透调节物质最多；除120 mg/L GA3处理组的脯氨酸含量外，其他各缓解组的4 种渗透调节物质含量均与A 组差异显著(P＜0.05)。

图1 2 种苜蓿幼苗的渗透调节物质含量Fig.1 Content of osmotic adjustment substances in two alfalfa seedlings

2.2 GA3 对混合盐胁迫下苜蓿幼苗叶片保护酶活性的影响

由图2 可知：外源GA3缓解NaCl 和Na2SO4混合盐胁迫时，随着GA3质量浓度的增加，POD、CAT、SOD、APX 和PAL 活性均呈先升高后降低的变化趋势，除阿迪娜的120 mg/L GA3处理组外，其他缓解组的5 种叶片保护酶活性均高于CK 组和混合盐胁迫组 (A 组)。可见，施加一定质量浓度GA3可促进酶活性，以缓解混合盐对苜蓿幼苗的胁迫。进一步分析苜蓿叶片保护酶活性的变化可知：60～120 mg/L GA3处理下5 种酶活性均有较大提升，除SOD 活性外，其他各缓解组的4 种酶活性均显著高于A 组(P＜0.05)。

图2 2 种苜蓿幼苗的酶活性Fig.2 Enzyme activities in two alfalfa seedlings

2.3 外源GA3 对缓解苜蓿幼苗盐胁迫的综合评价

由表2 可知：不同质量浓度(30～150 mg/L)GA3对苜蓿混合盐胁迫均有良好的缓解作用，但相较于高质量浓度GA3(120～150 mg/L)和低质量浓度GA3(30 mg/L)处理，60 和 90 mg/L GA3处理缓解盐胁迫的效果更好(平均隶属函数值较大)；此外，60 mg/L GA3处理下阿迪娜的平均隶属函数值最大(0.960)，而90 mg/L GA3处理下龙牧801 的平均隶属函数值最大(0.905)，说明混合盐耐性弱的龙牧801 较混合盐耐性强的阿迪娜需要相对较高质量浓度的外源GA3。

表2 激素缓解混合盐胁迫下2 种苜蓿幼苗9 项指标隶属函数值Tab.2 Membership function values of nine indexes of two alfalfa seedlings under hormone alleviating mixed salt stress

3 讨论

3.1 外源激素对植物叶片渗透调节物质的影响

植物激素除在正常条件下控制植物的生长发育外，还可以调节包括盐胁迫在内的各种环境胁迫，从而调节植物的生长适应性[13]。盐胁迫可对植物造成渗透胁迫和离子毒害等不利影响，在调节植物应对非生物胁迫的响应中，植物激素的利用对调整体内激素的代谢和信号发挥了重要的协同调控作用[14-15]。抵御盐胁迫时，植物细胞可通过积累脯氨酸等渗透调节物质来调节细胞内的渗透势，缓解盐离子进入细胞造成植株失水而带来的伤害[16]，且适宜的外源激素和浓度可促进渗透调节物质的积累。100 mmol/L NaCl 胁迫下，外源100 mg/L GA3可明显增加德国鸢尾(Iris germanicaL.)的可溶性糖和可溶性蛋白等渗透调节物质含量，缓解渗透胁迫造成的伤害[17]；用0.4% Na2SO4胁迫处理草莓(Fragaria×ananassaDuch.)，其植株体内脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等渗透调节物质含量均下降，喷施外源 GA3可提高这些渗透调节物质的含量[18]。本研究发现：在NaCl+Na2SO4胁迫下喷施一定质量浓度的GA3可提高渗透调节物质积累，其中，60 mg/L GA3处理下阿迪娜苜蓿叶片的可溶性糖、可溶性蛋白和甜菜碱积累最多，90 mg/L GA3处理下龙牧801苜蓿叶片的可溶性糖、脯氨酸和甜菜碱积累最多，与相关研究报道GA3缓解盐胁迫的结论基本一致。施加外源GA3后，苜蓿幼苗可通过生理代谢的调节减轻NaCl+Na2SO4混合盐胁迫造成的伤害，特别是 60～90 mg/L GA3处理能明显增加混合盐胁迫对紫花苜蓿幼苗的渗透调节能力，提高植株抗盐害能力，这与外源激素GA3的调控作用密不可分。

3.2 外源激素对植物叶片保护酶活性的影响

植物体内产生抗氧化酶以维持活性氧产生从而调控植物的一系列生理生化反应，外源激素可以提高植物的抗盐碱性，抵消盐胁迫对植物生长的抑制作用[19]。0.3% NaCl 胁迫下，外源GA3能显著提高泡桐幼苗叶片中的抗氧化酶活性，有效缓解盐胁迫所引起的氧化损伤，提高植物的抗盐能力[20]。本研究发现：NaCl+Na2SO4盐胁迫下，苜蓿叶片的抗氧化酶活性均有不同程度的提高，其中，60 mg/L GA3处理下阿迪娜苜蓿幼苗的SOD、POD、APX 和PAL 活性均最高，120 mg/L GA3处理下CAT 活性最高；而龙牧801 苜蓿幼苗的5 种酶活性变化不同，POD 活性在GA360 mg/L、SOD活性在GA390 mg/L 以及CAT、APX 和PAL 活性在GA3120 mg/L 处理下最高。GA3可通过启动不同的抗氧化酶系统缓解盐胁迫对苜蓿幼苗的伤害，与相关研究报道激素缓解盐胁迫的结论基本一致。外源GA3处理可以通过增加植物抗氧化酶活性来提高植物的抗氧化能力，以抵抗非生物胁迫。

4 结论

在NaCl+Na2SO4盐胁迫下，外源施加30、60、90、120 和150 mg/L GA3可使阿迪娜和龙牧801紫花苜蓿幼苗叶片积累渗透调节物质并提高保护酶活性，以缓解混合盐害，且60～90 mg/L GA3处理的缓解作用最好。