李 颖,何依依,孙俊薇,张治萍,梅馨月,王海宁,刘屹湘,李作森
(1.云南农业大学,农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室,云南生物资源保护与利用国家重点实验室,云南 昆明 650201;2.云南农业大学 烟草学院;云南 昆明 650201)
间作是指同一田地上于同一生长期内分行或分带相间种植2 种或2 种以上作物的种植方式[1],与单一种植模式相比,具有提高土地利用率、改善作物—病原物的生态平衡、控制病虫害暴发并获得更多有效养分等优势[2]。间作能有效抵御植物病害,植株形成天然的通风道,可有效降低田间空气湿度,增加田间透气性,阻挡病源菌的相互传播和交叉传染,减轻病害发生[3-4]。研究表明:间作不但能有效控制气传病害发生,对生产中难以防治的土传病害也有很好的防控效果,如辣椒‖玉米可抑制辣椒疫病[5],大蒜‖烟草可显著防治烟草黑胫病[6],小麦‖蚕豆可有效防控小麦锈病的发生[7]。
引起辣椒疫病的辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)是一种广泛传播并具有毁灭性危害的土传病原菌,许多研究表明:辣椒与其他作物间作是防控辣椒病害最普遍且最具经济效益的措施[8]。玉米‖辣椒系统中,玉米形成的“根墙”可限制辣椒疫霉菌跨行传播[5];韭菜‖辣椒系统中,韭菜根系分泌物能显著抑制辣椒疫霉菌的侵染[9],表明地下部分形成的“根墙”和根系分泌物是抑制疫霉菌传播的关键因素。茴香可以有效抑制由真菌、细菌、线虫和卵菌等引起的土传病害[10-12]。生产上可以利用茴香与烟草合理轮作或间作控制烟草黑胫病的发生和危害,茴香根系分泌物能够干扰烟草疫霉菌的侵染并抑制其菌丝生长[13]。另有研究显示:蚕豆‖小麦可减轻由对羟基苯甲酸引起的自毒效应,提高蚕豆根系中 POD 和SOD活性,有效降低蚕豆枯萎病发生[14]。
病情指数和病害发生率常被用于评估植物群体的发病程度和危害程度,但病害发生率只代表发病普遍率,不能反映发病程度;病情指数虽代表了发病程度,但病情指数相同时,病株率可能相差很大[15]。TRINDER 等[16]通过建立符合逻辑增长的Logistic 模型获得初始增长率、渐近最大值、最大瞬时生长速率和达到目标的时间等4 个建模参数对植物动态生长过程进行评估。WEI等[17]通过该模型研究了施氮量对三七皂苷含量、生物量、养分吸收和根系构型的影响以及这些参数间的关系;ZHANG 等[18]利用Logistic 模型量化施肥和地膜覆盖引起的种间竞争动态规律。本研究使用Logistics 模型分析单作和间作对辣椒疫病的影响,通过10 次病害调查测定2 种种植模式下作物的生物量、根系形态和酶活性,明确不同种植模式下辣椒疫病的病害发生率和病情指数变化情况,以获得预防辣椒疫病的最佳时机。
供试辣椒苗购自昆明市晋宁区育苗基地,茴香种子购自昆明市盘龙区茨坝农贸市场,茴香和辣椒种植地位于云南省昆明市寻甸回族彝族自治县云南农业大学现代教育基地(N25°20′,E102°41′,海拔2 369.9 m)。
辣椒疫霉菌菌株#501 由云南农业大学农业生物多样性控制病害教育部重点实验室提供。
1.3.1 试验设计
于2021 年5—9 月选择未种植过辣椒且未暴发过辣椒疫病的地块进行小区试验。试验小区长5.25 m、宽3.00 m,小区与小区间的过道宽40 cm,每个重复27 个小区,4 个重复共计108 个小区。种植方式为辣椒单作、茴香单作和辣椒间作茴香,其中,茴香单作仅用于测定干质量和根冠比,其种植模式与辣椒单作一致。单作和间作种植模式的示意图见图1。
图1 单作(a)和间作(b)种植模式的小区示意图Fig.1 Planting patterns of monoculture (a) and intercropping (b) plot
1.3.2 供试植株种植
茴香于2021 年5 月10 日播种,生长至6 月5 日;育苗盘育苗约45 d 移栽辣椒苗,于2021年6 月5 日完成移栽,进行后期田间管理,观察田间作物的生长情况,及时处理缺苗和多苗。
1.3.3 供试菌株培养
供试培养基:V8 培养基。制备方法:取V8果汁150 mL、CaCO31.5 g 和琼脂粉 20 g,加入ddH2O 定容至1 L;121 ℃高压蒸汽灭菌20 min,待温度降至60 ℃后倒入90 mm 塑料培养皿中,每皿15 mL,冷却后保存备用。
菌株培养:将辣椒疫霉菌菌株活化至制备好的V8 培养基平板上,于25 ℃光暗交替培养箱中培养5~6 d,备用;将活化的V8 固体培养基疫霉菌平板用5 mm 打孔器沿菌落边缘打孔转接至新的V8 固体培养基平板上,于25 ℃光暗交替培养箱中培养7~13 d,备用。
1.3.4 辣椒疫霉菌接种
于2022 年7 月24 日采用茎基部伤口贴菌饼法接种辣椒疫霉菌,接种辣椒条带的中心4 株辣椒,后观察辣椒疫病发病及扩散情况。
1.3.5 病害调查方法及分级标准
接种病原菌5~7 d,接种株开始发病;于接种病原菌13 d 后开始对病害进行调查,每隔3 d调查1 次,共调查10 次,并按症状对病情进行分级。分级标准为:0 级,全株无病;1 级,1/5 以下侧枝发病,或茎基部出现水渍状病斑;2 级,1/5~1/2 侧枝发病,或茎基部出现腐烂病斑,但植株不萎蔫;3 级,1/2~3/4 侧枝发病,或茎基部有腐烂病斑,植株有可恢复的萎蔫现象;4 级:全株 3/4 以上侧枝发病,部分枝条枯死,或植株呈不可恢复的萎蔫现象;5 级,全株枯死。利用病害发生率和病情指数对病情进行评价,计算公式为:病害发生率=病株数/调查株数×100%;病情指数=100×∑(各级病情级别植株数×各级病情级别代表值)/(调查总植株数×最高病情级别代表值)。统计植株发病率和病情指数时除去接种的中心株[19]。
1.3.6 辣椒和茴香生物量的测定
于2021 年9 月4 日对每个小区间作行位置的辣椒和茴香进行取样,每个小区取48 株辣椒和60 株茴香。取样时将整株植株从地里取出,洗净后把地上部及地下部分开,于105 ℃杀菌1 h,置于60 ℃烘箱烘干至恒质量,称量干质量。
1.3.7 辣椒根系的形态指标及酶活性测定
病原菌接种第7 天后采集辣椒根系,放入自封袋内做好标记,放入4 ℃冰箱保存备用。
(1) 根系形态指标测定。将辣椒根系置于盛有适量水的亚克力盒中,铺开后使用根系扫描仪(Epson Perfection V750 Pro) 进行扫描,得到的图片经WinRHIZO 软件处理得到根总长、根直径、根表面积和根体积等指标数据。
(2) 根系酶活性测定。将辣椒根系放入灭菌的研钵中用液氮进行研磨,称量根系粉末0.1 g置于无酶离心管中,分别加入超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)试剂盒中的提取液,于振荡机上混匀,放入离心机于4 ℃、12 000 r/min 离心10 min,吸取上清液于新的无酶离心管中待测。根据试剂盒说明书对待测液进行处理,然后放入酶标仪中测定不同波长(SOD:450 nm;POD:470 nm;CAT:510 nm)下各溶液的吸光光度值,并参考试剂盒说明书计算酶活性。SOD、POD 和CAT 试剂盒均购自苏州格锐思生物科技有限公司。
1.3.8 Logistic 模型对辣椒疫病发病率和病情指数的评估
逻辑增长曲线可以评估植物从出生到死亡的动态变化,故运用逻辑增长曲线评估辣椒疫病的发病率和病情指数,分析辣椒疫病在单作和间作2 种种植模式下发生的规律。分别整理辣椒单作和辣椒间作茴香10 次调查时间的病害发生率和病情指数数据,使用最小二乘法将数据拟合到Logistic 方程中[16,20],使用OriginPro8 软件的统计程序Slogistic1 得到病害发生率和病情指数增长曲线、瞬时增长速率以及病害传播时期的最大病害发生率和最大病情指数(a)、初始增长率(K)、最大瞬时生长速率(Imax)和达到目标的时间(t50)等4 个参数。
采用Excel 2016 和SPSS 26.0 软件对数据进行统计分析,两组处理间的方差分析运用独立样本t检验分析,试验数据用“平均值±标准误”表示。
由表1 可知:辣椒‖茴香可提高茴香生物量,其中间作模式的地上干质量显著高于单作模式;单作模式的茴香根冠比与间作模式相近;单作模式的辣椒地上干质量高于间作模式,但地下干质量和根冠比低于间作模式。说明间作模式可促进茴香生长和辣椒根系发育。此外,辣椒‖茴香模式的土地当量比为2.16 (大于1),说明辣椒‖茴香比单作效率高,间作增产率为116%。
表1 不同种植模式辣椒和茴香的生物量和根冠比Tab.1 Biomass and root shoot ratio of pepper and fennel with different planting patterns
由图2 可知:不同种植模式下辣椒根系有显著差异,辣椒‖茴香有利于辣椒根系形态生长。辣椒‖茴香模式下,辣椒的根长和根表面积极显著大于辣椒单作,根直径和根体积显著大于辣椒单作。
图2 不同种植模式下单株辣椒的根系指标Fig.2 Root indexes of per pepper plant with different planting patterns
由表2 可知:辣椒单作根系的POD 活性大于辣椒‖茴香模式,但两者无显著差异;辣椒单作根系的SOD 和CAT 活性极显著低于辣椒‖茴香模式。说明辣椒‖茴香可显著提高辣椒根系SOD和CAT 活性。
表2 不同种植模式辣椒根系的酶活性Tab.2 Enzyme activity of pepper root system with different planting patterns U/g
2.4.1 辣椒疫病发病率和病情指数
由图3 可知:与辣椒单作相比,辣椒‖茴香可降低辣椒疫病病害发生率和病情指数。接菌13 d后,辣椒单作的病害发生率为36.1%、病情指数为30.6,间作模式的病害发生率为3.4%、病情指数为2.6;接菌40 d 后,辣椒单作的病害发生率为100.0%、病情指数为99.3,间作模式的病害发生率为31.4%、病情指数为26.2。从辣椒疫病开始侵染至侵染后期,间作模式显著降低了辣椒疫病的病害发生率和病情指数。
图3 不同种植模式辣椒疫病病害发生率和病情指数Fig.3 Incidence and disease index of Phytophthora capsici under different planting patterns
2.4.2 不同种植模式辣椒疫病病害发生率和病情指数的Logistic 模型
由图4 和表3 可知:Logistic 模型对不同种植模式下辣椒病害发生率的拟合良好(0.943≤R2≤0.967,P<0.05)。2 种种植模式下辣椒疫病病害发生率的初始增长速率(K)无显著差异,且间作模式的K值小于辣椒单作;间作可显著降低辣椒疫病的最大病害发生率(a),并显著推迟达到辣椒疫病病害最大增长速率的时间(t50);间作还可显著降低病害发生率的最大瞬时增长速率(Imax)。此外,Logistic 模型对不同种植模式下辣椒疫病病情指数的拟合良好(0.961≤R2≤0.980,P<0.05)。2 种种植模式下辣椒疫病病情指数的K值无显著差异,且间作模式的K值小低于辣椒单作;间作可显著降低辣椒疫病的最大病情指数(a)和病情指数的Imax值,并推迟达到辣椒疫病病情指数最大增长速率的时间(t50)。
图4 不同种植模式辣椒疫病病害发生率和病情指数的瞬时增长速率Fig.4 Instantaneous increase rates of P.capsici and disease index under different planting patterns
表3 辣椒疫霉菌病害发生率和病情指数的Logistic 生长曲线估算参数Tab.3 Estimated parameters of disease incidence and disease index of Phytophthora capsici by Logistic growth curve
间作中植物根系互作可以有效控制土壤病原菌传播,控制病害流行[21]。大量研究发现:低秆作物辣椒与高秆作物玉米间作时,不但能有效降低叶部病害的发生,还能有效控制辣椒疫病的传播和扩展[22]。茴香作为具备强化感作用的蔬菜,常被用于与其他作物间、套作控制田间病虫害。孟玉芳等[23]研究发现:茴香根系分泌物对烟草疫霉菌的孢子有很强的吸引作用甚至能使其孢子裂解。本研究提出以茴香为低秆作物与高秆作物辣椒间作对辣椒疫病进行防控,并对不同种植模式中辣椒疫病的发生动态进行了分析,结果表明辣椒‖茴香具备提高产量的优势,同时能够有效控制辣椒疫病的发生和危害。本研究中,辣椒‖茴香的土地当量比大于1,能够促进茴香地上部和地下部生长,说明辣椒‖茴香能够高效利用资源促进茴香的生长以提高土地当量比,这可能是茴香种子先于辣椒播种,茴香根系前期充分吸收土壤中的营养,与后移栽的辣椒竞争具备优势。李隆等[24-25]曾提出种间间作体系中物种通过竞争恢复过程实现最终高体系生产力,例如玉米‖小麦体系中,小麦先播种并在共生期具备竞争优势,而玉米虽然共生期生长受限,但能够在小麦收获后快速恢复生长,进而实现体系生产力优势。这种竞争—恢复模式可能是辣椒‖茴香具备产量优势的重要原因。
物种根系互作促进营养吸收并调控根系微生态是间作能够增加产量和控制土传病害的重要原因[26]。本研究中,间作辣椒的根长、根表面积、根体积和根直径均显著高于单作辣椒,同时根冠比也高于单作,说明间作辣椒在茴香提前播种具备竞争优势的情况下增加了碳水化合物对根系的分配,扩大根系分布,增强养分和水分吸收能力。这种变化有助于增强辣椒在种间互作中的竞争能力,这可能是辣椒‖茴香中辣椒具备竞争优势的同时仍能保持产量不下降的重要原因。已有研究表明:间作体系中作物的根系形态与其竞争能力密切相关,如小麦‖玉米中,间作小麦根系分布和密度显著高于单作,可帮助其在共生期竞争中获得优势,而玉米的生长则受到抑制[25]。蚕豆‖玉米中,蚕豆因提前播种而在共生期具备竞争优势,玉米虽在生长初期受到限制,但更高的根长和密度在后期帮助玉米恢复到了单作水平[27]。因此,植物根系生长状况可以增强作物在间作系统的竞争力,有助于增加产量。
本研究发现:间作不仅能促进辣椒根系生长,还能显著提高辣椒根系的SOD 和CAT 活性。POD、SOD 和CAT 是植物中重要的保护酶,酶活性增强可以提高植物对活性氧的耐受能力,进而帮助植物抵御病害,降低病情指数[28]。由此可见,间作辣椒根系具备更强的抗氧化能力,有利于辣椒更好地抵御辣椒疫病。玉米与大豆、马铃薯间作也能显著增强叶片的POD、SOD和CAT 活性,提高玉米的抗病能力,有效控制玉米锈病的发生和蔓延[29]。董艳等[30]研究表明:小麦‖蚕豆模式中,蚕豆根系的POD、SOD 和CAT均具有较高活性,提高了蚕豆自身生理抗性和抗病能力,减轻了蚕豆枯萎病的发生。由此可见,间作能够通过提高植物组织生理生化反应,降低病原菌及有害物质对植株的伤害,抑制病原菌对植株的侵染。
已有研究基于生物量和产量数据拟合Logistic 曲线评估植物的动态生长过程[16-17]。本研究通过Logistic 曲线评估2 种种植模式的辣椒疫病发病率和病情指数,结果表明:间作可以降低发病率和病情指数的最大值和最大瞬时增长速率,推迟达到该最大增长速率的时间。这一结果说明辣椒‖茴香对辣椒疫病跨行传播的抑制主要是通过降低病害的增长速率和推迟病害发生高峰期的时间,也进一步验证了间作模式下酶活性增加可提高对辣椒疫病的抗性。孟飞等[31]通过聚类分析对24 份玉米品种顶腐病进行评估,比较准确地确定了品种的抗病程度。然而,该方法对于遗传距离较大的作物抗病程度评估较为困难。Logistic 模型常用于评估植物的生长动态,而病害发生动态的不稳定性比生长动态更强,且受环境因素影响较大,因此,Logistic 模型拟合病害发生瞬时增长速率曲线的精确度受到了一定的影响,后期研究将通过增加样本量提高拟合曲线的精确度。
辣椒‖茴香可通过促进茴香生长以增加体系生产力,其中间作辣椒的根长、根表面积、根直径和根体积明显增加可能是间作辣椒保证产量不受抑制的重要原因。间作可通过降低辣椒疫病最大增长速率、推迟病害高峰期时间以降低辣椒疫病的危害;此外,间作可以提高辣椒根系的SOD 和CAT 活性,这可能也是间作控制辣椒疫病的重要作用机制。