GeXP多重PCR技术对老年呼吸道感染患者常见呼吸道病毒的检测及病毒流行特征分析

曾勇军，黄欢欢，欧阳雨晴，曾勇彬

呼吸道病毒是通过呼吸道传播、在呼吸道黏膜上皮细胞中增殖、导致呼吸道感染或呼吸道以外组织病变的一类病毒。老年人由于年龄增长，生理及免疫功能减退，再加上各种基础性疾病，出现呼吸道病毒感染(respiratory tract infection, RTI)的机会和死亡率均比年轻人群高[1-2]。呼吸道感染可由细菌、支原体、衣原体和病毒等病原体引起，其中常见的病毒有流感病毒(influenza virus, IFV)、副流感病毒(human parainfluenza virus, HPIV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)和人鼻病毒(human rhinovirus, HRV)等[3]。由于不同病毒感染的临床症状和体征较为相似，因此，及时、准确检测和鉴别呼吸道病毒对辅助临床医生的诊断和治疗具有重要意义。

目前，RTI的检测方法包括病毒培养、免疫学技术、PCR技术等[4]。病毒培养是“金标准”，但该方法操作步骤复杂、耗时耗力、对技术、设备要求高，不适宜在临床实验室应用；免疫学技术相对简单，但病毒感染至少6 d才可产生IgM抗体，患者既往感染产生的抗体可导致检测出现假阳性，其检测敏感度和特异性仍有待提高；PCR方法对病毒检测灵敏、特异，但一般情况下常规PCR 1次反应只能检测到1～3种病毒，通量较低。对于老年患者而言，由于呼吸道病原体诊断不明确、不及时，临床医生多采用经验性治疗，易导致药物的不科学使用及治疗的延误。因此，寻找一种准确、快速、通量大、灵敏度高、特异性强的呼吸道病毒检测方法尤为重要。

GenomeLab GeXP多重基因表达遗传分析系统是一种新的基因表达谱分析平台，能在一个反应中对多达30种靶基因进行分析，巧妙地将多重 PCR技术和毛细管电泳技术结合，采用通用引物与特异引物相结合的方法实现多重、灵敏、特异、快捷检测的目的[4-5]。笔者采用GeXP多重PCR技术检测11种呼吸道病毒核酸，包括甲型流感病毒(influenza A virus, IFVA)、甲型流感病毒H1N1(influenza A virus H1N1, H1N1)、甲型流感病毒H3N2(influenza A virus H3N2, H3N2)、乙型流感病毒(influenza B virus, IFVB)、腺病毒(human adenovirus, HADV)、博卡病毒(bocavirus, BOCA)、HRV、HPIV、冠状病毒(human coronavirus, HCOV)、RSV、偏肺病毒(human metapneumovirus, HMPV)等，探讨其应用价值，并进一步分析老年呼吸道感染患者呼吸道病毒的流行特征，为临床诊治提供帮助。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2020年1月—2021年12月就诊笔者医院年龄、性别相匹配的老年(≥60岁)呼吸道感染患者。纳入标准：呼吸道感染诊断标准参照《内科学》(第9版)相关标准[6]。上呼吸道感染的诊断标准：(1)包括普通感冒、急性病毒性咽炎和喉炎、急性疱疹性咽峡炎、急性咽扁桃体炎相关病史；(2)典型症状如发热、头痛、鼻塞、咽痛等表现；(3)胸部X射线检查阴性。下呼吸道感染的诊断标准：(1)包括急/慢性支气管炎、气管-支气管炎、肺炎、支气管肺炎、支气管扩张相关病史；(2)咳嗽、咳痰等症状；(3)肺部出现干、湿啰音；(4)X射线胸片多为肺纹理增强。排除标准：入院前已使用抗生素、抗病毒药物等。本研究经笔者医院伦理委员会批准(闽医大附一伦理医技审[2015]084-1)，患者均知情同意。

1.2 试剂与仪器 病毒核酸提取试剂盒(宁波市重鼎生物技术有限公司)、呼吸道病原体多重检测试剂盒(宁波海尔施基因科技股份有限公司)、GenomeLab GeXP遗传分析系统及毛细管电泳相关试剂(如DNA标准分子片段-400、矿物油、分离胶等)(美国贝克曼库尔特有限公司)、PCR扩增仪(美国Life Technologies公司)。

1.3 标本采集和核酸提取 按照《全国临床检验操作规程(第4版)》[7]留取患者标本(鼻咽拭子、痰、支气管肺泡灌洗液)及判断标本留取质量。痰液标本：平均每低倍镜视野鳞状上皮细胞数<10个；肺泡灌洗液：鳞状上皮细胞数<细胞数的1%。采用商品化病毒核酸提取试剂盒提取标本中的核酸。

1.4 核酸扩增 病毒的核酸扩增包括逆转录反应和PCR反应。逆转录反应条件为：(1)25 ℃退火5 min。(2)50 ℃逆转录15 min。(3)95 ℃灭活逆转录酶2 min。PCR反应条件为：(1)94 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s，重复6个循环。(2)94 ℃ 30 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s，重复29个循环。(3)72 ℃ 10 min。(4)反应产物4 ℃ 保存。

1.5 GeXP平台检测 (1)制备电泳样品。上样缓冲液28.7 μL，标准分子片段(SizeStandard-400)0.3 μL，PCR产物1 μL，矿物油1滴。(2)准备分离液。将200 μL分离液加入96孔板上适当数目的孔中。(3)利用GeXP多重基因遗传分析系统毛细电泳分离样品。

2 结 果

2.1 一般情况 共纳入老年呼吸道感染患者694例，其中男性496例，女性198例，其人口统计学特征见表1。本研究所测标本的总体阳性率为14.99%(104/694)，不同种类病毒阳性检出率差别有统计学意义(χ2=156.26，P=0.00)，最常见的病毒为HRV(6.05%，42/694)；其次为HADV(3.60%，25/694)和IFVA(2.31%，16/694)；其他病毒为HCOV(1.44%，10/694)、H1N1(1.15%，8/694)、HRSV(0.86%，6/694)、IFVB(0.58%，4/694)、HMPV(0.58%，4/694)和HPIV(0.29%，2/694)。呼吸道病毒在不同性别、不同呼吸道感染部位及不同标本类型的检出率差别均无统计学意义(表1)。

表1 694例老年呼吸道感染患者人口统计学信息及病毒总体检测情况

2.2 GeXP多重PCR技术检测结果的确认 分别采用无RNA酶水和携带相应病毒核酸的质粒作为无模板对照(no-template control, NTC)和阳性对照(positive control, PC)。在NTC中只出现人DNA内参(huDNA)峰和RT-PCR内参(internal control, IC)峰，且2个内参峰的峰高均高于标准品峰高，未观察到除内部参考外的峰；在PC中出现11个病毒峰，且病毒峰区分良好，高度均高于标准品峰高度，表明GeXP多重PCR技术的检测结果准确可靠(图1)。

A：无模板对照；B：阳性对照。

2.3 单一病毒检出阳性率与混合病毒检出阳性率情况 检出单一病毒91例(13.11%，91/694)，占阳性标本的87.50%(91/104)；检出混合病毒13例(1.87%，13/694)，占阳性标本的12.50%(13/104)。单一病毒检出率高于混合病毒检出率(87.50%vs12.50%，χ2=117.00，P<0.001)。混合病毒检出主要是IFVA与其他病毒的共同检出，占混合病毒检出的61.54%(8/13)，其中IFVA与H1N1合并检出占混合病毒检出的46.15%(6/13)(表2)。

表2 老年呼吸道感染患者单一病毒检出阳性率与混合病毒检出阳性率情况

2.4 不同年龄组呼吸道病毒检出阳性率情况 将老年呼吸道感染患者按年龄分成3组：60～69岁组、70～79岁组、≥80岁组。≥80岁组阳性检出率最高(21.62%，40/185)，其次是70～79岁组(阳性检出率15.92%，39/245)和60～69岁组(阳性检出率14.39%，38/264)。不同年龄组病毒检出阳性率比较，差别无统计学意义(χ2=4.29，P=0.12，表3)。

表3 不同年龄组呼吸道病毒检出阳性率分布情况

2.5 不同季节呼吸道病毒检测情况 根据季节分为4组：春季(3—5月)147例，夏季(6—8月)216例，秋季(9—11月)182例，冬季(12、1、2月)149例。不同季节病毒检出情况见表4。总体而言，在春、冬季病毒检出阳性率较高，分别为29.25%(43/147)和20.13%(30/149)。病毒在冬、春季节的检出阳性率更高(χ2=28.04，P<0.001)。不同病毒检出情况各不相同，H1N1、HMPV有明显的季节分布特征，冬季和春季均有较高的检出率。HRV、HADV多为散发，四季均有检出，无明显季节差别。

表4 不同季节呼吸道病毒检出阳性率分布情况

3 讨 论

RTI是引起老年患者死亡的原因之一，给家庭和社会带来较大的医疗负担[2]。快速、准确、高通量检测老年人呼吸道感染的病原体，了解其流行特征，对老年人呼吸道感染的预防和治疗具有重要的意义。GeXP多重基因表达遗传分析系统是将毛细管电泳分离技术、多重PCR技术和荧光标记相结合的一种检测分析系统。与普通PCR技术相比，该技术具有快速、灵敏、高通量等优势，已应用于呼吸道感染性病原体的检测[4, 8]。本研究中采用的GeXP多重PCR技术能在4 h内完成13种呼吸道病原体(包括11种病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体)的检测，可帮助临床医生及时地进行呼吸道感染的早期干预。

本研究中，呼吸道病毒检测阳性率为14.99%，与魏菁菁等[9]的报道类似，但低于前期(2020年之前)上海、河北等地区的研究[10-11]，可能的原因之一是，随着新型冠状病毒肺炎的流行，人们加强自我防护意识，如戴口罩、保持适当的社交距离、减少聚集等，从而减少了呼吸道病毒的传播，降低了呼吸道病毒检测的阳性率。研究[12]表明，老年人感染HRV的风险是年轻人的10倍，感染IFV的风险是年轻人的5倍。本研究中，老年呼吸道感染患者病毒感染阳性率检出最高的是HRV，其次是INFA和HADV，与其他报道[13]一致，且男女之间的病毒检出阳性率无明显区别。

通过年龄分组分析发现，呼吸道病毒的检出率随着年龄的增加而增加，≥80岁组检出率最高，与文献[10]报道一致，可能的原因是随着年龄的增长，老年人患基础性疾病的概率增加，免疫力下降，从而增加了患呼吸道感染的风险。呼吸道感染可存在多种混合感染，一种病毒可引起多种临床症状，一种症状也可由多种病毒引起。在本研究中，混合感染13例，阳性率为1.87%，占阳性标本的12.50%；其中INFA与H1N1合并感染最多，与其他研究[11]有所差别，可能是由于不同地区病毒感染的流行情况不一所导致。RTI具有明显的季节性差别，本研究呼吸道病毒在春、冬季节的检出率明显高于夏、秋季节，考虑气候变化是导致病毒检出率呈季节性变化的重要因素，寒冷天气易引起鼻黏膜血管收缩，降低抵抗力；另外寒冷天气老年人户外活动显著减少，室内聚集增加，空气不流通，从而增加呼吸道感染的风险。IFV包括IFVA、H1N1、IFVB、H3N2，是引起老年人RTI死亡的一个重要原因，并且通常发生在冬、春季[14]。在本研究中，IFV是第二常见的病毒，其中IFVA占57.14%，IFVB占10.71%,与其他报道相符[15]，人HMPV感染也有明显的季节特征，同样在冬、春季节有较高的检出率。然而，HRV、HADV多为散发，四季均有检出，无明显季节差别。

综上所述，GeXP多重PCR技术简便、快速、灵敏，可同时检测多种呼吸道病毒核酸，辅助临床的呼吸道感染诊断和治疗。本研究还分析了老年患者RTI的流行病学特征，可为老年人呼吸道感染的预防和治疗提供帮助。本研究的局限在于研究为单中心，今后有必要通过多中心进一步证实；另外，本研究旨在了解老年呼吸道感染患者病毒的流行特征，尚未对其他呼吸道病原体如细菌性病原体、肺炎支原体、肺炎衣原体等进行分析，后续计划进行其他病原体的检测及分析，为临床诊疗提供更多有用的信息。除此之外，今后如能结合呼吸道病毒特征和患者的诊疗数据(如基础性疾病、住院时长、影像学数据、实验室数据等)，进行深入、全面地分析，将会获得更有价值的结果。