甲状腺乳头状癌中环状RNA_0015278的表达及临床意义

丁华杰，杨绍石，李 莎，史华宁，龚 雪，王小杰

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinom, PTC)是常见的恶性肿瘤，其发病率有逐年上涨趋势，已成为女性第五大常见肿瘤。PTC预后良好，局部5年生存率达95%以上，但远处转移患者的5年生存率约50%。此外，长期随访中发现25%的PTC患者复发[1]。因此，迫切需要寻找新的肿瘤标志物来监测PTC的发生、发展，以提高对其的诊断、治疗及远期监测。环状RNA(circRNA)属于非编码RNA，通过海绵状微小RNA和调节RNA结合蛋白调节各种生物学过程[2-3]。最新研究表明，circRNA可以通过调节各种信号来调节癌症的发病机制及进展[4-5]。circRNA被认为是潜在的临床肿瘤生物学标志物，其活性稳定、易于提取[6-7]。有研究表明：circ_0002111、circ_0006156和circ_0137287作为临床肿瘤标志物，具有改善PTC患者管理的潜力[8-10]。Circ_0015278是新近发现的circRNA，可以抑制几种肿瘤的进展，包括非小细胞肺癌和卵巢癌[11-12]。本文旨在探讨circ_0015278对PTC的诊断价值及与临床病理特征的关系，为其临床诊断及预后评估提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料收集2017年1月～2020年12月承德医学院附属医院经甲状腺手术切除的206例PTC及癌旁组织；收集患者年龄、性别、肿瘤大小、有无甲状腺外侵、病理性T期(pT)、病理性N期(pN)、病理性TNM期(pTNM)、辅助放射性碘治疗等。筛选标准：(1)手术切除的肿瘤组织及癌旁组织保存良好，可用于RNA分离，主要临床病理资料完整。(2)术前均未接受PTC治疗，均无其他恶性疾病史。

1.2 qRT-PCR法应用qRT-PCR检测PTC及癌旁组织中circ_0015278的表达。每个样品的qRT-PCR重复检测3次，循环条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，合计40次循环。qRT-PCR中使用以下试剂盒：TRIzol试剂(美国Thermo公司)、RNase R iScript cDNA合成试剂盒(随机引物)(美国Bio-Rad公司)、QuantiNova SYBR Green PCR试剂盒(德国QiaGen公司)。GAPDH作为内控基因被分离。使用2-ΔΔCt方法计算circ_0015278的相对表达。circ_0015278正向引物：5′-TGGCTGTGGCTGTGTTAGG-3′，反向引物：5′-TTCATT GGTCTGTGGATCATATCG-3′；GAPDH正向引物：5′-GACCA CAGTCCATGCCATCAC-3′，反向引物：5′-ACGCCTGCTTCAC CACCTT-3′。

2 结果

2.1 临床特征206例PTC患者中，男性50例(24.3%)，女性156例(75.7%)；平均年龄(43.9±11.3)岁。肿瘤平均最大径为(3.5±1.6) cm，84例(40.8%)有甲状腺外侵，122例(59.2%)无甲状腺外侵。pT1期29例(14.1%)，pT2期62例(30.1%)，pT3期55例(26.7%)，pT4期60例(29.1%)。pN0期69例(33.5%)，pN1期137例(66.5%)。pTNM分期：Ⅰ期111例(53.9%)，Ⅱ期16例(7.8%)，Ⅲ期47例(22.8%)，Ⅳ期32例(15.5%)。此外，57例(27.7%)患者接受了放射性碘的辅助治疗。

2.2 PTC组织中circ_0015278的表达与癌旁组织[1.001(0.750，1.358)]相比，PTC组织中circ_0015278的表达降低[0.342(0.222，0.573)](Z=-14.146，P<0.001，图1)；ROC生存曲线分析显示，circ_0015278的表达以0.740为截断值时，在鉴别PTC和癌旁组织之间具有良好的价值(AUC：0.903，95%CI：0.847～0.932，图2)。

图1 PTC及癌旁组织中circ_0015278的表达

图2 PTC及癌旁组织中circ_0015278的表达ROC曲线

2.3 PTC中circ_0015278表达与临床病理特征的关系PTC组织中circ_0015278高表达与患者年龄<45岁(b=-0.147，P=0.021)、无甲状腺外侵(b=-0.134，P=0.036)、低pT分期(b=-0.165，P=0.005)、低pN分期(b=-0.192，P=0.003)和低pTNM分期(b=-0.181，P=0.002)相关。未发现circ_0015278表达与患者性别(b=0.053，P=0.404)及肿瘤最大径(b=-0.100，P=0.117)相关(表1)。

表1 PTC中circ_0015278表达与临床病理特征的关系[n(%)]

3 讨论

circRNA作为特殊的非编码RNA，具有数量众多、结构稳定及高度保守等特征，能充当微小RNA(microRNA, miRNA)分子海绵、调节基因转录、剪接及参加蛋白质的翻译等。近年研究表明，circRNA作为miRNA海绵通过调节miRNA活性，从而降低miRNA结合和下调蛋白编码转录本的能力[13-15]，参与多种肿瘤的发生、发展等重要生物学功能，成为近年关注的热点[16]。有研究表明：circ_100290通过miR-29b调控CDK6的表达，促进口腔癌细胞增殖。circ_0052112作为miR-125a-5p的分子海绵，促进乳腺癌细胞的迁移及侵袭。circ_PSMC3通过miR-296-5p海绵，抑制胃癌细胞的增殖与转移[17-19]。李莹等[20]报道miR-133在甲状腺滤泡性癌(follicular thyroid carcinoma， FTC)细胞中表达下调，且与FTC高分期具有相关性，提示miR-133在FTC的发生、发展中可能起重要作用，miR-133在FTC、PTC及结节性甲状腺肿伴腺瘤中的表达差异有显著性。最近研究也发现circRNAs异常表达与PTC进展有关[21]，测序分析表明PTC中hsa_circ_0001681(circRNA RAPGEF5或circRNA GEF5)的表达异常增加[22-24]。

近年甲状腺癌的发病率及复发率迅速增加，尽管临床治疗技术不断进步，但仍然有较高的发病率及复发率[25]。circ_0015278是新发现的circRNA，可以抑制多种癌症的进展。在非小细胞肺癌中，circ_0015278过表达通过海绵状microRNA-1228减少细胞增殖。在卵巢癌中，circ_0015278通过miR-1228/p53/EMT信号抑制细胞增殖和转移[11-12]。本组206例PTC组织中circ_0015278的表达较癌旁组织减少，circ_0015278高表达可能作为miR-1228的海绵，增强野生型p53的活性(如卵巢癌)，野生型p53是甲状腺肿瘤发生的关键抑制因子[26]。文献报道circ_0015278的高表达，与非小细胞肺癌患者的淋巴结转移呈负相关[11]。本组发现PTC组织中circ_0015278高表达与患者年龄、肿瘤大小、甲状腺外侵、pT分期、pN分期和pTNM分期呈负相关，其中与患者年龄、甲状腺外侵、pT分期、pN分期和pTNM分期差异有统计学意义(P<0.05)，提示PTC组织中circ_0015278高表达与患者年龄<45岁、无甲状腺外侵、较低的pT、pN及pTNM分期相关；circ_0015278表达与患者性别及肿瘤大小均无关(P>0.05)。原因如下：(1)circ_0015278可能抑制PTC生长，导致PTC分期降低[27]。(2)circ_0015278可通过海绵状miR-1228降低PTC细胞的EMT，与无甲状腺外浸润及pN0分期有关。(3)circ_0015278可能通过调节miR-1228/p53/EMT信号通路抑制PTC细胞的增殖、迁移和侵袭，从而抑制PTC的进展。因此，在PTC组织中circ_0015278高表达与较低的pTNM分期相关。

本实验有下列局限性：(1)随访时间相对较短，circ_0015278在PTC组织中的预后价值有待进一步分析。(2)仅考察了在PTC组织病理中circ_0015278的临床价值，而在外周血、尿液等来源RNA的应用价值有待进一步分析。(3)PTC组织中一些circRNAs失调，本组未涉及circ_0015278调控PTC进展的分子机制，有待进一步分析。

综上所述，circ_0015278在PTC组织中表达减少，其高表达与PTC患者年龄<45岁、无甲状腺外侵及较低的pT、pN及pTNM分期相关，circ_0015278有望成为改善PTC患者治疗及判定预后潜在的肿瘤生物学标志物。