改性壳聚糖基纳米核酸药物的制备及性能研究

林冠权

(圣诺生物医药技术(广州)有限公司，广东 广州 510000)

小干扰核酸(siRNA)[1-2]是一种短片段的双链RNA分子，其基因沉默效应具有高特异性和高效性。因此，siRNA可用于治疗病毒感染、遗传性疾病、癌症等疾病[3-4]。然而，裸露的siRNA在血清中极易被RNase类酶降解，且难以进入细胞，即使进入了细胞，也无法有效地从内涵体中逃逸到细胞质中。所以，裸露siRNA很难在体内发挥作用以达到治疗的效果[5-6]。因此，开发有效的核酸递送载体，构建合适的纳米核酸药物是提高siRNA基因沉默效应，达到其治疗效果的主要途径。

壳聚糖是一种无生物毒性的多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性、无免疫原性，能被人体分解吸收，常用于食品及医药领域。壳聚糖的分子链段上具有多个氨基，氨基质子化后形成铵根离子，呈正电性，可与带负电的核酸通过静电作用力结合，因而壳聚糖是良好的核酸载体[7-8]。但壳聚糖的亲水性能差，转染效率低的局限性，严重阻碍其临床的应用[9]。因此，通过二甲基二烯丙基氯化铵改性壳聚糖，以提高壳聚糖的水溶性；通过构建纳米核酸药物，以提高siRNA的转染效率，达到基因治疗的效果。

1 实 验

1.1 仪器和试剂

实验仪器：400 MHz核磁共振波普NMR，德国布鲁克；Chromate 4300酶标仪，Awarenes technology；Quant Studio 3实时荧光定量PCR仪，赛默飞世尔有限公司；1220凝胶成像仪，上海天能科技有限公司；nano-ZS90纳米粒度与zeta电位仪，英国马尔文仪器有限公司；FD-1C-50冷冻干燥机，无锡沃信流体设备科技有限公司；ES1035A电子天平，天津市德安特传感技术有限公司。

实验试剂：壳聚糖(30000 Da)，上海麦克林；二甲基二烯丙基氯化铵(60wt%水溶液)，上海麦克林；小干扰核酸(siTGF-β1+siCOX-2)，苏州贝信；过硫酸铵(分析纯)，上海麦克林；三聚磷酸钠(分析纯)，上海阿拉丁；冰醋酸(分析纯)，上海麦克林；氢氧化钠(ACS级)，上海阿拉丁；细胞RAN快速提取试剂盒(50T)，北京聚合美。

1.2 二甲基二烯丙基氯化铵改性壳聚糖(CS-g-PDMDAAC，简称CP)的制备及表征

取壳聚糖于烧瓶中，加入pH 5的醋酸钠缓冲溶液，搅拌使其完全溶解，得到12 mg/mL的壳聚糖溶液，加入与壳聚糖质量比为6:1的二甲基二烯丙基氯化铵单体，磁力搅拌混匀，在80 ℃下回流10 min。取与壳聚糖质量比为0.5:1的过硫酸铵于烧杯中，加入超纯水使其完全溶解，得到30 mg/mL的过硫酸铵溶液，再滴加进回流体系中，反应3 h，冷却至室温，透析，过滤，冷冻干燥，获得壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵(CP)干粉。采用核磁共振氢谱对CP的结构进行表征。

1.3 纳米药物的制备

把CP干粉溶于超纯水，得到1 mg/mL的CP溶液。把1 mg/mL的siRNA溶液和1 mg/mL的三聚磷酸钠(ST)置于离心管中混匀，把CP溶液注入离心管中，涡旋混匀，得到siRNA/CP纳米核酸药物。通过琼脂糖凝胶电泳测试siRNA的结合情况。

1.4 纳米核酸药物的性能测试

细胞活性测试[10]。把样品与opti-MEM培养基混合后，置于96孔板中转染6 h，去掉样品液，用含10%血清的1640培养基培养24 h，往96孔板中每孔加入10 μL CCK8，静置1 h。采用酶标仪在450 nm的测试波长中测试细胞的活力情况，重复三次。

抑制基因表达测试[11]。把样品与opti-MEM培养基混合后，置于12孔板中转染6 h，移除样品液，用含10%血清的1640培养基培养24 h，通过RT-PCR评估基因敲除效率。

2 结果与讨论

2.1 结构表征分析

图1是壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵(CP)的核磁共振氢谱图，4.80 ppm是重水的溶剂峰。1.89 ppm是壳聚糖乙酰基的质子峰[12]。3.54 ppm为壳聚糖亚甲基的质子峰。3.48 ppm、3.01 ppm处是N上所连-CH3的质子峰；3.72 ppm、2.82 ppm是接枝单体聚合物中-CH2-上H的吸收峰；3.37 ppm为接枝单体聚合物中次甲基的质子峰；5.56 ppm、5.86 ppm是CH2=CH-上H的多重吸收峰，这可能是聚合物末端链终止所形成的双键。这说明DMDAAC已成功接枝于CS主链上。

图1 CS-g-PDMDAAC的1H NMR谱图

2.2 siRNA/CP纳米核酸药物包裹性能测试分析

siRNA中存在多个磷酸二酯键，在水溶液中呈负电；CP中存在多个铵根离子，在水溶液中呈正电。siRNA与CP通过静电作用自发结合形成纳米粒子，而siRNA与CP的结合情况需通过琼脂糖凝胶电泳观察。实验结果如图2所示，图2中CP与siRNA的质量比为16:1时有拖带的现象，说明在此质量比下制备的纳米核酸药物不能很好包裹siRNA，存在结合较差或游离的siRNA。在CP与siRNA的质量比为24:1时，没发现拖带和siRNA特征条带，说明在此质量比下CP能很好的与siRNA结合。三聚磷酸钠为物理交联剂，可进一步压缩纳米颗粒，提高纳米核酸药物的稳定性。结果显示，在CP:ST:siRNA的质量比分别为24:2:1和24:1:1时，均没发现结合较差和游离的siRNA。通过凝胶滞留分析可筛选出纳米核酸药物中包裹性能较好的比例配方，除了CP与siRNA的质量比为16:1的配方以外，上述配方得到的纳米核酸药物可很好的包裹siRNA，达到保护siRNA的作用。根据图3粒径分布图可知，CP:ST:siRNA的质量比为24:2:1时，纳米核酸药物的粒径为180 nm。

图2 琼脂糖凝胶电泳图

图3 siRNA/CP纳米核酸药物粒径分布图

2.3 细胞活性分析

LIPO2000是一种适用于基因表达和基因沉默的高性能转染试剂。在图4细胞活性图中得知，LIPO2000组的细胞毒性较大，细胞活性为63%。CP组的细胞活性为101%，ST组的细胞活性为118%，说明CP载体和ST离子交联剂对细胞的生长具有促进作用，CP和ST两者对细胞具有无毒性。虽然CP与ST混合后发现，CP:ST组的细胞活性为87%，具有低毒性，但与LIPO2000组对比，CP:ST组的安全性也具有很大优势。与LIPO2000组相比， siRNA/LIPO2000组的细胞活性下降约10%，说明siRNA对BXPC3细胞的活力具有一定的抑制作用。同理，与CP组相比，CP:ST:siRNA(24:2:1)组的细胞活性下降了20%。从细胞活性的下降程度对比，CP:ST:siRNA(24:2:1)组优于siRNA/LIPO2000组，这主要源于CP的高安全性及良好的转染效率。

图4 细胞活性结果图

2.4 抑制目的基因表达性能分析

siRNA使用的是siTGF-β1与siCOX-2两两混合的小核酸，siRNA通过与特定的mRNA互补结合后切割mRNA，阻断了mRNA翻译成蛋白质的表达路线，从而沉默了该编码基因的表达，达到治疗的效果。图5是mRNA表达水平图，GFP组是阴性对照，对于目的基因的表达没有任何的抑制作用，siRNA/LIPO2000组是阳性对照，TGF-β1与COX-2的mRNA表达水平均有不同程度的下降,这源于LIPO2000具有高效的转染性能。CP:ST:siRNA(24:1:1)组的两组mRNA表达抑制水平不及阳性对照组，CP:siRNA(24:1)组的COX-2的mRNA表达抑制水平不及阳性对照组。24:2:1(CP:ST:siRNA)组的两组mRNA表达抑制水平均优于阳性对照组，说明CP载体的转染效率在一定程度上优于LIPO2000，在CP:ST:siRNA质量比为24:2:1时制备的纳米核酸药物，其具有较高的抑制目的基因表达效率。

图5 mRNA表达水平结果图

3 结 论

siRNA具有特异性及高效性，对于癌症及遗传学疾病具有良好的治疗效果，但裸siRNA难以完整地进入细胞内部以发挥治疗的作用。需要通过构建药物/载体复合体，保护siRNA免被酶分解的同时，提高siRNA的转染效率。

通过接枝聚合制备壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵核酸载体，与siRNA、离子交联剂ST通过静电作用力结合型成纳米核酸药物。结果显示，CP:ST:siRNA的质量比分别为24:2:1时，能很好的包裹siRNA。CP具有较高的安全性，能促进细胞的生长。CP:ST:siRNA的质量比为24:2:1时，纳米核酸药物具有良好的抑制目的基因表达的作用。本文制备的核酸载体有望发展为平台性技术，为多种核酸药物的有效递送提供可能。