核酸分析仪校准结果不确定度的评定

陈 飒，张 倩

(中检西北计量检测有限公司，陕西 西安 710068)

核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的总称，一直被认为是存储和传递遗传信息的分子。核酸是细胞的一种主要成分，支配着蛋白质的合成，主宰着人体的生长、发育、繁殖、遗传及变异等一切重大的生命活动，对人体的新陈代谢、免疫功能调节都起着重要的、决定性的作用。核酸分析仪可用于单个和多重PCR片段、限制性内切酶消化的DNA、合成的寡聚核苷酸、总RNA等片段长度和浓度的分析。通常由进样器、毛细管/微芯片、荧光检测光学部件、微电路控制部件、计算机及应用软件组成。目前，新型冠状病毒肺炎是全球都投入其中的一场战役，核酸检测过程包括标本处理、核酸提取，进行PCR检测等多个步骤，核酸分析仪是使用中必不可少的一个部分，故需通过计量保证核酸分析仪结果的准确性和一致性。测量不确定度是表征计量结果的一个重要参量。

测量不确定度简称不确定度，是指根据所用到的信息，表征赋予被测量量值分散性的非负参数。这种分散性有两种情况：(1)由于各种随机性因素的影响，每次测量得到的值不是同一个值，而是以一定概率分布分散在某个区间内的许多值。(2)虽然有时实际上存在着一个恒定不变的系统性影响，但由于不知道其值，也只能根据现有的认识，认为它以某种概率分布存在于某个区间内，可能存在于区间内的任意位置，这种概率分布也具有分散性。为了表征测得值的分散性，测量不确定度用标准偏差或其特定倍数表示，或者用说明了包含概率的区间半宽度表示，用标准偏差表示的测量不确定度称为标准不确定度，测量不确定度表示为标准偏差的特定倍数或给定概率下分散区的半宽时称扩展不确定度。测量不确定度一般由若干分量组成。其中一些分量可根据一系列测得值的统计分布，按测量不确定度的A类评定方法(统计方法)进行评定，并用实验标准差表征。而另一些分量则可根据经验或其他信息假设的概率分布，按测量不确定度的B类评定方法(非统计方法)进行评定，也用标准偏差表征。通常，对于一组给定的信息，测量不确定度是与赋予被测量的量值相联系的。本实验根据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》要求以及JJF1817-2020《核酸分析仪校准规范》，对核酸分析仪校准过程中产生的片段浓度示值误差和片段长度示值误差进行评定，为正确评价和使用校准结果提供了更为合理和科学的依据。

1 测量过程简述

1.1 测量依据

JJF1817-2020《核酸分析仪校准规范》。

1.2 测量环境条件

(1)环境温度：15～30 ℃;

(2)相对湿度：不大于80%;

(3)其他要求：实验室环境应当满足分析仪安装的要求，不得存在强烈的机械振动和电磁干扰，并确保校准过程中环境温度变化小于3 ℃。

1.3 测量标准[1]

1.3.1 标准物质

表1 计量标准物质

1.3.2 校准用试剂和溶液

(1)纯水：符合GB/T6682规定的一级水;

(2)三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)：分析纯;

(3)乙二胺四乙酸(EDTA)：分析纯;

(4)TE缓冲液的配制

用0.00001 g的天平称量1.576 g的Tris-HCl，0.292 g的EDTA，加入至1 L的三角瓶内加入700 mL一级水，待全部溶解后，调节pH至8.0，然后用1 L的量筒定容。

(5)示值误差和重复性校准用标准溶液

用TE缓冲液将DNA片段标准物质稀释为2 ng/μL的标准溶液。

1.3.3 配套设备

表2 配套设备

1.4 被校对象[2-3]

核酸分析仪：型号NANODROP 2000C；厂家Thermo 本规范适用于基于凝胶电泳原理对核酸片段的长度和浓度进行分析的核酸分析仪的校准，适用于核酸片段长度范围为100～1000 bp。

1.5 测量方法

采用分析仪直接测定DNA片段含量标准物质，并与标准物质的标称值进行比较。

1.6 测量过程[4]

(1)核酸分析仪在校准前应将低温保存的标准物质及配套试剂提前从冰箱拿出，必须检查标准物质及配套试剂有效使用日期，使用有效期内的试剂并且确保其在使用前平衡至室温。

(2)标准物质及配套试剂在平衡30 min后按1.3.2的要求配制。

(3)试剂配制完成后打开核酸分析仪，预热10 min，检查气瓶的压力。

(4)片段长度及片段浓度示值误差校准：预热完成，仪器自检通过后，参照仪器使用说明书，用移液器将标准溶液加入到校准板中，按表3所示准备校准板，然后将准备好的校准板置于核酸分析仪内进行测量10次，记录10次片段长度及片段浓度测定值，10次测量结果的算术平均值减去标准物质的标准值，即为核酸分析仪的片段长度和片段浓度的示值误差。计算出10次测量结果相对实验标准偏差，作为片段长度和片段浓度的重复性。

表3 12联排管加样排布方式

1.7 评定结果的使用

在符合上述条件下的测量结果，一般可直接使用本不确定度的评定结果。

2 数字模型[1]

长度校准结果的示值误差按照式(1)计算：

(1)

浓度校准结果的示值误差按照式(2)计算：

(2)

3 测量不确定度来源分析[5]

3.1 长度示值误差的不确定度

标准物质的定值不确定度；

环境条件、人员操作和被校仪器等各种随机因素引入的重复性不确定度。

3.2 浓度示值误差的不确定度

标准物质的定值不确定度；

环境条件、人员操作和被校仪器等各种随机因素引入的重复性不确定度。

4 测量不确定度的评定[5]

4.1 长度示值误差的不确定度评定

4.1.1 标准物质的定值不确定度u1(Cs1)的评定

采用320BP寡聚DNA含量标准物质，其定值相对扩展不确定度为7.1%，包含因为k=2。则标准物质的定值不确定度引起的标准不确定度分量为：

u1(Cs1)=3.6%/2=1.8%

(3)

由环境条件、人员操作和被校仪器等各种随机因素引入的重复性的相对标准不确定度，可采用A类评定。

对被校核酸分析仪按仪器说明书，将准备好的校准板置于分析仪内进行测量，本次使用300bp的核酸标准物质进行示值校准，记录10次片段长度及片段浓度测定值。并按式(4)计算各校准点相对标准偏差，各校准点的具体测量数据如表4所示。

表4 各校准点A类评定结果

(4)

(5)

4.1.3 长度示值误差合成标准不确定度计算

测量不确定度分量汇总及计算表如表5所示。

表5 标准不确定度汇总表

长度示值误差合成不确定度为：

4.1.4 长度示值误差扩展不确定度U

取包含因子k=2，则：

U=k×uC=4%

4.2 浓度示值误差的不确定度评定

4.2.1 标准物质引入的标准不确定度u(Ccons)

进行含量校准时使用的标准物质稀释液，该标准物质稀释液引入的不确定度u(Ccons)包含了未稀释的标准物质的不确定度u(Cy-con)和稀释过程引入的不确定度，未稀释的标准物质的不确定度可以根据标准物质的证书提供的扩展不确定度U(Ms)和包含因子k(Ccon)根据下式计算：

(6)

式中：u(Cy-con)——标准物质引入的标准不确定度

U(Cy-con)——标准物质证书提供的扩展不确定度

k(Cy-con)——标准物质证书提供的包含因子，通常为2

320 bp标准物质稀释前的含量标准值为110.6 mg/kg，其定值相对扩展不确定度为7.1%，则换算为绝对误差引入的不确定度为3.92 ng/μL，(k=2),则由标准物质引入的标准不确定度：

原标准物质的相对标准不确定度为：urel(Cy-con)=0.01772

采用天平称量稀释，稀释过程引入的不确定度即天平称量的不确定度包括天平偏载误差、天平称量重复性、示值误差，合成后由天平称量稀释引入的相对标准不确定度为0.0028。则稀释后的工作标准物质的相对不确定度为：

urel(Ccons)=0.01794

稀释后的标准物质引入的标准不确定度为：

u(Ccons)=0.036 ng/μL

在校准中DNA含量测定结果的值分别为2.51 ng/μL、2.66 ng/μL、2.75 ng/μL、2.65 ng/μL、2.58 ng/μL、2.51 ng/μL、2.74 ng/μL、2.69 ng/μL、2.54 ng/μL、2.78 ng/μL，单次测量的实验标准偏差s(xi)为：

则测量结果平均值的标准不确定度为：

4.2.3 测量不确定度分量汇总及计算

表6 标准不确定度汇总表

合成不确定度为：

4.2.4 浓度示值误差扩展不确定度U

取包含因子k=2，则：

U=k×uC=0.11 ng/μL

5 结 论

(1)由上述不确定度评定过程可知，核酸分析仪校准不确定度[5]主要来源于标准物质引入的不确定度和测量重复性引入的不确定度，标准物质引入的不确定度的评定采用了B类不确定度评定的评定方法进行计算，测量重复性引入的不确定度的评定采用了A类不确定度评定的评定方法进行计算。

(2)在实验室质量管理过程中，应注意标准品称量时可选择精度更高的电子天平，对仪器设备定期进行质量控制，实验人员校准时可适量增加平行试验的次数来降低不确定度，标准物质采买时要注重考查等级及不确定度，从而提高实验的准确度，减少不确定度，最终优化和完善实验室质量管理。

(3)本文不确定度的评定方法采用GUM法,先是分析不确定度来源和建立测量模型，然后评定标准不确定度u，再计算合成标准不确定度uC，最后取包含因子2，计算出扩展不确定度，最终结果为：长度示值误差扩展不确定度U=4%(k=2)；长度示值误差扩展不确定度U=0.11(ng/μL)(k=2)。