BTG2、ARL2在非小细胞肺癌组织中的表达及与其临床病理特征和预后的相关性

杜伟鹏 徐 曼 汪海霞 包 孟

肺癌是全球癌症死亡的主要原因之一，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的80%以上[1-2]。尽管近年来在NSCLC的早期诊断和治疗方面取得了一些进展，但NSCLC患者的预后仍然很差[3]。当前的研究方向是确定新的治疗靶点和策略，并将它们纳入现有的治疗方案，以提高治疗效果。ADP的核糖基化样因子2(ARL2)是ADP核糖基化因子(ARF)家族的成员，是位于11号染色体(11q13)上的高度保守基因。ARF亚家族在DNA复制、转录、重组和修复中起重要作用[4]。ARL2的过度表达能够将结直肠癌细胞的迁移、增殖和致瘤性进行抑制[5]。在宫颈癌中，ARL2表达较其癌旁组织更高，且与患者不良预后相关[6]。BTG2(B细胞异位基因2)基因是BTG/TOB家族的重要成员。已知该家族基因的过度表达在体外抑制细胞增殖，BTG蛋白可能在细胞周期调节或细胞凋亡中起作用[7]。BTG2 mRNA在胸腺癌组织中表达丢失，而在小鼠胸腺中高表达，这表明BTG2在胸腺癌变过程中具有潜在作用[8]。此外，与非致瘤性乳腺上皮细胞相比，BTG2在人乳腺癌细胞系中的表达明显降低[9]。同时有研究发现，ARL2、BTG2均是急性髓系白血病的促凋亡基因，二者与急性髓系白血病的化疗耐药有关[10]。但是目前尚无关于ARL2、BTG2表达与NSCLC关系的研究报道，因此本研究拟探讨ARL2、BTG2蛋白在NSCLC患者癌组织中表达水平及临床预后意义，以期为NSCLC的治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2014年10月至2016年9月间本院收治的非小细胞肺患者126例为研究对象，收集相应的原发NSCLC组织及相应的癌旁正常组织。标本用10%福尔马林固定并包埋在石蜡中进行病理检测及免疫组化检测。该研究获得本院研究伦理委员会的批准。在手术前获得患者的知情同意。

纳入标准：①病理诊断确认为非小细胞肺癌；②患者术前未接受化疗或放疗；③NSCLC疾病组织学根据世界卫生组织的标准确定；④根据当前国际抗癌联盟肿瘤淋巴结转移分类进行病理分期。排除标准：①年龄、性别、病史和肿瘤信息不完整；②术后随访失败或死亡原因不明；③存在其他恶性肿瘤或恶性肿瘤因其他突发疾病(包括心脑血管疾病)死亡；④怀孕或哺乳的患者。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫组化法测定ARL2、BTG2表达及判定标准 对所有126个组织标本进行免疫组织化学分析。切片在二甲苯中脱蜡，并使用分级酒精系列脱水，然后用甲醇中的0.5% H2O2封闭内源性的过氧化物酶活性10 min。在室温条件将切片和10%正常山羊血清于磷酸盐的缓冲盐水 (PBS) 内孵育1 h把非特异性抗原阻断。在不洗涤的情况下，将切片与抗ARL2、BTG2(1∶1000，1∶2000；中国碧云天生物科技)在PBS中于4 ℃下孵育过夜。生物素化山羊抗兔免疫球蛋白 G(1∶400；Sigma，St Louis MO，USA)与切片在室温下孵育1 h，并用链霉亲和素-过氧化物酶复合物检测。通过将切片与0.1% 3,3-二氨基联苯胺(Sigma)在含有0.05% H2O2的PBS中室温孵育5 min。组织标本由两名病理学家在双盲条件下分别查看，其事先不了解标本的临床病理状态。ARL2、BTG2在NSCLC标本中的表达通过在低倍(×40)下扫描整个组织标本进行评估，然后在高倍(×200和×400)下进行确认。阳性细胞的百分比被记为“0”(<5%，阴性)、“1”(5%～25%，弱阳性)、“2”(25%～50%，中阳性)和“3”(>50%，强阳性)，分别染色强度分别记为“0”(无染色)、“1”(弱染色)、“2”(中等染色)和“3”(强染色)。阳性细胞百分比和细胞染色强度均以双盲方式确定。最终ARL2、BTG2免疫染色分数是使用阳性细胞分数的百分比乘以染色强度分数计算的，范围为0～9。

1.2.2 随访 术后的每3个月利用电话及问卷调查方式将全部的合格患者的信息进行更新。从最开始的手术日期直至死亡时间点计算总生存期。通过家庭报告确定参与者的死亡，并通过查阅公共记录进行核实。所有患者出院后均电话随访5年，随访率为100%。

1.3 统计分析

应用统计软件包SPSS 21.0进行数据处理。计数资料以率(%)表示，采用χ2检验分析ARL2、BTG2表达与临床病理特征的关系，使用log-rank检验分析生存率差异，多因素Cox比例风险模型探讨预后相关因素，P<0.05被认为具有统计学上的显著差异。

2 结果

2.1 ARL2、BTG2在癌旁组织、非小细胞肺癌组织中表达比较

由表1可见，非小细胞肺癌组中ARL2蛋白阳性率高于癌旁组(66.7% vs 25.4%)，BTG2蛋白阳性率低于癌旁组(20.6% vs 71.4%)(P<0.05)。

表1 ARL2、BTG2在癌旁组、非小细胞肺癌组中表达比较(例，%)

2.2 ARL2、BTG2蛋白表达与非小细胞肺癌临床病理特征的关系

由表2可见，ARL2、BTG2蛋白表达与患者年龄、性别无关(P>0.05)；与肿瘤最大直径、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移、病理分级、复发相关，且肿瘤最大直径至少5 cm、浸润深度越深、TNM分期越高、病理级别越高、出现淋巴结转移、有复发非小细胞肺癌患者ARL2阳性表达率更高，BTG2阳性表达率更低(P<0.05)。

2.3 非小细胞肺癌患者预后生存情况

126例非小细胞肺癌患者中，自出院后至随访结束存活4～60个月，5年生存率为47.6%(60/126)；其中ARL2阳性和阴性5年总生存率分别为26/84(31.0%)和34/42(81.0%)，而BTG2阳性和阴性5年总生存率分别为25/26(96.1%)和35/100(35.0%)；ARL2阴性、BTG2阳性非小细胞肺癌患者5年生存率均显著增高，差异均具有统计学意义(χ2=21.254、18.205，P<0.001)。

表2 ARL2、BTG2蛋白表达与非小细胞肺癌临床病理特征的关系(例，%)

2.4 影响非小细胞肺癌患者预后的单因素分析

单因素分析得出：肿瘤最大直径至少3 cm、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、浸润深度至少为1 cm、出现了淋巴血管浸润、有复发、高病理级别、ARL2阳性、BTG2阴性的非小细胞肺癌患者5年内生存率下降明显(P<0.05)，见表 3。

表3 影响非小细胞肺癌患者预后的单因素分析(例，%)

2.5 非小细胞肺癌患者预后影响因素多因素Cox回归分析

Cox回归分析显示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、病理级别高、ARL2阳性、BTG2阴性是影响非小细胞肺癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)，见表4。

3 讨论

NSCLC是最常见的肺癌类型，其5年总生存率仅为39%[11]。最近，肿瘤的分子靶向治疗已被引入临床治疗，靶向癌症治疗的出现显著增加了患者生存期，同时最大限度地减少治疗毒性。然而，内在或获得性耐药机制限制了它们的临床疗效。因此，更好地了解NSCLC的分子机制有助于确定新的治疗靶点或开发新的NSCLC治疗方式。

ARL2是一种核和细胞外蛋白，参与多种生理和病理状况，包括免疫反应、炎症和癌症。比较源自卵巢癌的高侵袭性和低侵袭性亚克隆的基因表达谱的cDNA微阵列分析表明，高ARL2表达与较差的临床病理特征相关[12]。根据细胞定位，ARL2表达于癌细胞的细胞核和细胞质以及细胞外间隙，与食管鳞状细胞癌的淋巴结转移和预后相关。ARL2过表达与肿瘤分级、分期、较短的无病生存期和显著相关。从功能上讲，ARL2是成年生物体中自噬、线粒体质量控制、基因表达调节和器官功能所必需的[13]。敲除ARL2通过VEGF-C和NF-KB通路抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而ARL2的异位表达通过抑制BTB诱导的细胞凋亡和细胞迁移来促进前列腺癌细胞增殖、侵袭；此外ARL2通过信号素3A的表观遗传沉默，降低Bax和p53表达，并通过激活FAK/PI3K/mTOR通路增强Bcl-xL、Bcl-2、CyclinD1和NFKB的表达进而促进癌细胞增殖[14]。此外，细胞外ARL2增强了对P-gp相关药物(阿霉素和长春新碱)的抗性，而敲除ARL2可恢复化学敏感性[15]。在本研究中，我们通过免疫组化法测定出ARL2表达在NSCLC组织中显著高于相邻非肿瘤组织中的表达。这些观察结果支持ARL2可能作为NSCLC中的致癌基因的假设，也表明ARL2可能在NSCLC的肿瘤发生中起重要作用。此外，为了研究ARL2表达是否与NSCLC的进展有关，通过免疫组织化学比较了126例NSCLC患者的ARL2表达水平和临床病理特征。我们发现ARL2高表达与肿瘤分级、肿瘤大小、临床分期和淋巴结转移显著相关。Kaplan-Meier生存分析显示ARL2高表达与NSCLC患者的总生存率呈负相关。更重要的是，使用Cox回归模型的进一步分析证实，ARL2表达是预测NSCLC患者总生存时间的独立因素。这些发现提供了证据表明ARL2可被视为预测NSCLC患者预后的生物标志物。

BTG2是早期生长反应基因，在多种器官和组织中高度表达，包括肺、肠、胰腺和前列腺。BTG2的过表达可抑制某些肿瘤(包括肾癌细胞)的细胞增殖和侵袭，并与PRMT1协同发挥抗增殖基因的作用[16]；BTG2参与癌细胞的发育和分化，可以促进视黄酸诱导的造血细胞分化；BTG2能够促进或诱导细胞凋亡并抑制三阴性乳腺癌细胞的细胞侵袭；BTG2是p53靶基因之一，参与DNA损伤修复过程。它通过依赖于p53的Ras信号转导途径起作用，并在DNA受损时显著增加表达，BTG2在细胞增殖、分化、凋亡和DNA损伤修复中发挥重要作用[17-18]。近期研究发现，BTG2是p53依赖性Ras途径中的主要下游抗活性效应物，与人类肿瘤发生中的p53途径相关。BTG2通过抑制PI3K/AKT通路来抑制癌细胞的增殖和转移[19]。此外，BTG2过表达通过下调STAT3通路抑制白细胞介素6(IL-6)表达，并抑制JAK2-STAT3信号通路中活性氧(ROS)的产生，对癌细胞的生长有负面影响。BTG2表达也被氧化应激通过ROS蛋白激酶C-ΝFκΒ途径上调，该途径与p53状态无关。因此，BTG2参与了一些对癌症发展和进展至关重要的途径。本研究中非小细胞肺癌组BTG2蛋白表达阳性率低于癌旁组；BTG2蛋白表达与肿瘤最大径、TNM分期、浸润深度、病理级别、淋巴结转移、复发相关性明显，且肿瘤最大肿瘤直径至少3 cm、TNM的分期为Ⅲ～Ⅳ期、浸润深度至少为1 cm、出现了淋巴血管的浸润、有复发、高病理级别、ARL2阳性、BTG2阴性的非小细胞肺癌患者5年内的生存率缩短明显(P<0.05)。TNM的分期为Ⅲ～Ⅳ期、高病理级别、ARL2阳性、BTG2阴性是影响非小细胞肺癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。这提示，BTG2蛋白在非小细胞肺癌患者癌组织中低表达，BTG2低表达是非小细胞肺癌患者预后的独立危险因素。

表4 非小细胞肺癌患者预后影响因素多因素Cox回归分析

综上所述，非小细胞肺癌患者癌组织中ARL2表达升高，BTG2蛋白表达降低；ARL2高表达、BTG2低表达是影响非小细胞肺癌患者预后的独立危险因素。