基于网络药理学与分子对接技术探讨石上柏在治疗癌症中的作用机制

武 乐 黄淑娟 余腾骅 邱宇安 方义文 梁 群 何 芳 刘利艳

随着人类生活方式的改变和环境的日益恶化，癌症的发病率越来越高，最新的研究报告[1-4]显示癌症的发病率和死亡率已经成为第二大威胁人类健康的疾病。在我国，癌症的发病率和死亡率也是呈逐年上升的趋势[5]。中医认为癌症属于多发病、常见病、难治病，预后一般欠佳。癌症属“正虚邪实”，“正气亏虚、毒瘀互结”是癌症发病的重要因素[6-8]，且认为，热毒内蕴可形成肿瘤，即热灼血凝，凝结成块，热灼津液，久积成块等。热邪可以直入，也可诸邪侵入，郁久化热;七情不舒，郁结成热等，同时癌症自身也可生热成毒。因此，清热解毒法在癌症治疗中起着重要的作用[9]。石上柏来源于卷柏科植物深绿卷柏(Selaginella doederleinii Hieron)的干燥全草，具有清热解毒、祛风除湿、抗癌、止血的功效，对于多种肿瘤生长有抑制作用，常配伍其他中药用于癌症的治疗，亦可配合放化疗，以减轻放化疗后患者出现的不适症状[10]。有研究显示石上柏或其提取物能对鼻咽癌、肝癌、肺癌、喉癌、卵巢癌有作用[11-14]。然目前对石上柏治疗癌症的作用机制尚不明确。基于此，为了进一步研究石上柏的抗肿瘤作用机制，以石上柏为研究对象，人类癌症疾病为靶标进行网络药理学研究，探究出石上柏在治疗癌症中的作用及其作用机制。

1 资料与方法

1.1 数据库及软件

本研究所涉及的数据库有:中药活性成分查询数据库TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、化合物查询数据库PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、靶点预测数据库swisstargetprediction (http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)、疾病靶点数据DisGeNET(http://disgenet.org)和Genecards(https://www.genecards.org)、数据交集数据库Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)、蛋白相互作用网络平台String(https://string-db.org/cgi/input.pl)；通路查询数据库KEGG(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)、蛋白数据库PDB(http://www.rcsb.org)、swissmodel(https://swissmodel.expasy.org)。所涉及的软件有：网络可视化Cytoscape3.7.1，通路富集与分子ClueGo2.5.4和CluePedia、R语言，分子对接软件DISCOVERY STUDIO软件等。

1.2 石上柏活性成分及靶点筛选

在TCMSP数据库中搜集石上柏所有的活性成分；并根据化合物的类药性(drug-likeness，DL)≥0.18、口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥20%为筛选条件(若设为≥30%，活性成分芹菜素未被涵盖，故设20%阈值)[15-17]。将纳入活性成分分别在PubChem、swisstargetprediction数据库中检索，筛选物种为“homo sapiens”的靶点，并对各活性成分作用靶点进行筛选(筛选条件为Probability≥0.05)，此即为石上柏的预测作用靶点。

1.3 疾病靶点筛选

在DisGeNET和Genecards数据库，以关键词“Cancer”进行检索，筛选条件分别为:Score_gda≥0.05(DisGeNET)，Relevance score≥10(Genecards)，并将石上柏活性成分预测靶点与癌症疾病靶点进行交集，得到共同的靶基因，绘制韦恩图。

1.4 药物-活性成分-靶点网络的构建

将药物与活性成分靶点(共同靶基因)数据导入Cytoscape中，绘制药物-成分-靶点网络图。

1.5 PPI网络的建立

将交集后的靶基因上传到String数据库，将研究物种选择为人类(Homo sapiens)，获取蛋白相互作用数据，结果以TSV格式导出，然后导至Cytoscape软件进行优化构建和分析蛋白相互作用网络(PPI)，节点大小和颜色均按“degree”排列，edge粗细和颜色均按“combined_score”排列；根据R语言筛出核心靶点，并绘制barplot图。

1.6 癌症靶点基因通路与功能分析

将筛选的核心靶基因输入ClueGo数据库，选择物种Homo sapiens，选择KEGG数据库富集的通路，以具有统计学差异“P<0.05”、“Kappa Score”等于1为筛选条件，对石上柏治疗癌症作用的潜在靶点进行生物学功能和通路分析。并用CluePedia对所得的通路图进行美化。最后构建石上柏-成分-靶基因-信号通路的网络拓扑图。

1.7 活性成分与关键靶点的分子对接验证

在上述步骤结果基础上，选择靶点数目最多的活性成分作为配体，PPI 网络中“degree”最大的靶点作为受体，进行分子对接。在PDB、swissmodel数据库下载所需蛋白结构，与pubchem下载的三维结构配体一一对接，使用Discovery Studio中的“Clean Protein”对蛋白进行初步准备，包括删除水分子，杂原子，加氢等步骤，再由程序定义蛋白活性位点。使用LibDock对接模式进行对接，Docking Preferences为High Quality，Conformation Methon为FAST，Number of Hotspots默认为100，Docking Tolerance值默认为0.25，与相应分子开始对接，对接完成后选取LibDockScore分值最高的分子-蛋白对接结构(LibDockScore>100，构象予以保留)。分析受体与配体相互作用，主要包括配体分子与蛋白间氢键，疏水，卤键，Pi-Pi相互作用等，并保存其结构图。

2 结果

2.1 石上柏活性成分以及靶点筛选

经条件筛选，共筛出10个活性成分。在检索预测靶点时发现，有2个化合物无相关作用靶点，余下8个活性成分，再经检索和筛选后，得到194个预测靶点。见表1。

表1 石上柏的活性成分及对应靶点

2.2 疾病靶点筛选

分别从DisGeNET和Genecards数据库中获取癌症相关的疾病靶点4511个和1521个，与194个预测靶基因一起输入Draw Venn Diagram进行交集后，得到共同靶基因78个，即为石上柏潜在作用靶点。见图1。

2.3 药物-活性成分-靶点网络的构建

将药物与活性成分预测靶点(共同靶基因)数据导入Cytoscape中，绘制药物-成分-靶点网络可视图(图2)。图2所示体现了石上柏治疗癌症具有多成分、多靶点协同作用的特点。连接度为前3的潜在活性成分分别为MOL007576(6-[5-(5,7-dihydroxy-4-keto-chromen-2-yl)-2-methoxy-phenyl]-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromone)、MOL000008(apigenin)和MOL000359(sitosterol)。

2.4 PPI网络的建立

将石上柏-癌症78个共同靶基因上传至String数据库平台获取蛋白质相互作用关系数据(TSV格式)，然后导至Cytoscape优化构建和分析蛋白相互作用网络(PPI)：PPI网络共有78个节点(共同靶基因)通过622条边发生作用，平均节点Degree为15.9。经R语言作出barplot图(图3)，从图中清楚可见VEGFA的Degree值为55，AKT1的Degree值为54，EGFR和ESR1的Degree值分别为47。

2.5 癌症靶点基因通路与功能分析

筛选出排名前30的核心基因，共计33个。经通路富集，得到42条信号通路，其中涉及癌症的通路19条，激素类5条，血管生成1条，免疫方面2条，代谢相关通路3条等(图4)，EGFR、AKT1、MMP3、GSK3B、VEGFA等基因作为cross-talk 基因参与到 2 条及以上通路中，这些通路和基因涉及癌症发生发展如细胞增殖、凋亡、转移、血管新生等重要生物过程。拓扑图显示石上柏治疗癌症具有多成分、多靶点的协同作用。

图1 预测靶点与疾病靶点交集韦恩图

2.6 活性成分与关键靶点的分子对接验证

经分子对接，显示活性成分(6-[5-(5,7-二羟基-4-酮-色烯-2-基)-2-甲氧基-苯基]-5,7-二羟基-2-(4-羟基苯基)色酮)(MOL007576)、芹菜素(MOL000008)均能与蛋白AKT1、VEGFA稳定结合。见表2。

注：圈内的8个节点分别代表8个活性成分，圈上和圈外均为作用靶点。

图3 各靶点相互作用的Degree分布(排名前50)

3 讨论

本研究运用网络药理学和分子对接的方法对石上柏治疗癌症的作用机制进行研究，从石上柏已知的30个成分中筛选出10个有效成分。通过对化合物靶点网络进行拓扑分析可以发现，(6-[5-(5,7-二羟基-4-酮-色烯-2-基)-2-甲氧基-苯基]-5,7-二羟基-2-(4-羟基苯基)色酮)(6-[5-(5,7-dihydroxy-4-keto-chromen-2-yl)-2-methoxy-phenyl]-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromone，MOL007576)、芹菜素(apigenin，MOL000008)和谷甾醇(sitosterol，MOL000359)可能是石上柏发挥作用的重要活性成分。 通过蛋白与蛋白之间的相互作用发现VEGFA、AKT1、EGFR 、ESR1、SRC、PTGS2、AR、MMP9、MMP2、IGF1R、KDR等蛋白为核心靶点。研究显示，芹菜素能通过下调MMP-2、MMP-9、Bak1蛋白表达水平,上调Caspase-3表达来有效抑制脑胶质瘤U87细胞增殖、促进凋亡[18]。通过Wnt/β-catenin信号通路来抑制喉癌细胞的增殖、迁移和侵袭[19]；通过m-TOR/PI3K/Akt信号通路来抑制顺铂耐药的肿瘤的生成[20]。血管内皮生长因子A(VEGFA) 是一种能刺激血管内皮细胞分裂增殖的糖蛋白，在体内广泛表达，与其受体 VEGFR 结合后，参与血管新生。研究显示芹菜素能通过抑制 VEGF(A和B)表达，从而达到抑制血管生成的目的[21]。

图4 癌症核心靶点所涉及通路

表2 6-[5-(5,7-二羟基-4-酮-色烯-2-基)-2-甲氧基-苯基]-5,7-二羟基-2-(4-羟基苯基)色酮)(MOL007576)、芹菜素(MOL000008)与蛋白分子AKT1和VEGFA对接示意表

β-谷甾醇通过AKT/GSK-3β信号通路抑制人胰腺癌的增殖、诱导其凋亡,抑制其迁移和侵袭[22],并通过激活线粒体介导的内源性凋亡途径和死亡受体介导的外源性凋亡途径诱导HepG2细胞凋亡。研究显示，其亦能抑制调控血管生成，从而促进肿瘤细胞凋亡[23]。我们研究与上述文献报道基本一致。

综上所述，本研究以网络药理学和分子对接技术初步验证了石上柏主要活性成分与潜在作用靶点之间的相互作用，阐述了石上柏治疗癌症具有“多成分-多靶点-多通路”的作用机制，为后续深入研究石上柏治疗癌症的分子机制奠定了理论基础。