吞噬细胞运动蛋白1和原钙黏附蛋白17启动子甲基化水平对胃癌早期诊断的价值分析

赵洪乾 范少鹏 范立奎 李 磊

胃癌(gastric cancer，GC)是临床上常见的肿瘤性疾病，尤其是随着人们生活方式和饮食习惯的改变，GC的发病率也在逐年增加[1-2]。据流行病学统计结果表明，2020年，全球范围内，确诊的新发胃癌病例约为74万例，其中89%以上病例出现在发展中国家，以中晚期胃癌为主[3]。单就我国而言，我国每年新发的胃癌患者约为12.4万例，约86%以上患者为中晚期胃癌，少数为体检发现的早期胃癌[4]。对于晚期胃癌患者，手术效果欠佳，多以放化疗为主，5年生存率较低[5-6]。因此，如何对GC患者做到早期诊断和早期治疗是临床上的热点问题。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传学改变，也是癌症发生的早期重要改变之一。相关研究表明，在胃癌患者血清组织中可见抑制基因(TSG)的甲基化，包括FAM5C，MYLK和p16等，并且可以在早期胃癌组织中表达量增加[7-8]。因此，检测胃癌患者中血清中DNA的甲基化水平可能是胃癌早期诊断的潜在方法。上皮内瘤变(IN)是一种潜在的癌前病变，具有GC的高风险，因此，住院患者的筛查对于GC的诊断和预测至关重要。因此，在本研究中，以吞噬细胞运动蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原钙黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)启动子甲基化水平作为检测指标，探求对胃癌早期诊断的作用，以期做到早期诊断和早期治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集自2018年1月至2020年1月我院普外科收治的147例患者为研究对象，其中胃上皮内瘤变者49例，肠上皮化生者40例，胃癌患者58例，并且以142例体检健康者作为对照组。

收集患者的一般资料，包括性别、年龄等，收集患者的临床病理学资料，包括肿瘤大小、位置、分化程度、淋巴结转移和TNM分期等。

1.2 纳入标准

①治疗前均经胃镜活检，明确胃癌的诊断；②无血液系统疾病；③无明显手术禁忌；④了解试验的目的和方法，签署知情同意书的患者。

1.3 排除诊断

①合并严重的内科疾病的患者，比如严重高血压，糖尿病，冠心病等，不适合手术治疗；②未签署知情同意书的患者。

1.4 血清标本收集和DNA抽提以及重亚硫酸盐修饰

抽取患者的清晨血，肘静脉取血后，将血清置于预先加入肝素的试剂管中保存，4 ℃预冷离心机离心2000 rpm，时间设置为15 min，抽提上层的血清，分装于1.5 ml的EP管中，置于-80 ℃以保存。

DNA的提取选择碧云天公司的血清DNA提取试剂盒，按照说明书要求配置Buffer AW1试剂和Buffer AW2试剂，取消融的400 μl血浆，置于EP管中，加入400 μlBuffer AL，恒温水浴箱孵育10 min，4 ℃预冷离心机离心2000 rpm，时间设置为15 min，取沉淀，加入400 μL无水乙醇，置于离心柱中，加入500 μL Buffer AW1试剂，4 ℃预冷离心机离心8000 rpm，时间设置为5 min，取沉淀，加入400 μl无水乙醇，置于新离心柱中，加入500 μl Buffer AW2试剂，4 ℃预冷离心机离心8000 rpm，时间设置为5 min，反复2次后，提取DNA样本以备用。在260 nm波长下通过光谱法测量DNA浓度。用Zymo-DNA修饰试剂盒对DNA进行亚硫酸氢盐处理。

1.5 甲基化特异性PCR检测(MSP)

经过亚硫酸氢盐处理后，DNA样本中的未甲基化胞嘧啶变为尿嘧啶，甲基化胞嘧啶不变。引物设计由上海瑞捷生物有限公司负责。PCR的MSP扩增体系选择Zymo Taq PreMix 反应体系，体积容量选择6.5 μl，MSP反应程序设置：95 ℃反应10 min，扩增40个循环，然后在95 ℃下处理30 s，退火温度设置为56 ℃下处理40 s，然后加入反应底物，琼脂糖凝胶中120 V电泳30 min，然后紫外成像系统下观察条带，引物序列见表1。

表1 ELMO1和PCDH17的基因序列

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 胃癌肿瘤组织的甲基化结果

结果显示，GC患者的肿瘤和相邻正常DNA样本进行全基因组Illumina甲基化EPIC芯片分析。比较了肿瘤和正常组织之间的甲基化结果，发现865918个CpG位点中的2180个(0.25%)在肿瘤组织中差异甲基化。这些CpG位点位于837个功能基因附近；肿瘤组高甲基化率为78.4%(1710个CpG位点)，低甲基化率为21.6%(470个CpG位点)。与数据库对比，认为吞噬细胞运动蛋白1(Engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原钙黏附蛋白17(Protocadherin 17，PCDH17)启动子甲基化水平变化最大。

2.2 各组患者血浆中ELMO1和PCDH17的琼脂糖结果

结果显示，与对照组患者血浆中ELMO1和PCDH17的含量相比，胃癌组，上皮内瘤变组和肠化生组的血浆含量明显升高(P<0.05)，见图1。

注：NC为对照组；IM为肠上皮化生组；IN为上皮内瘤变组；GC为胃癌组。

2.3 胃癌患者临床参数与血浆DNA甲基化的相关性分析

结果显示，外周血中ELMO1启动子甲基化与肿瘤分化程度呈正相关(OR=2.509，95%CI：1.207～3.424，P<0.05)，与淋巴结转移呈正相关(OR=2.427，95%CI：1.114～4.076，P<0.05)，与浸润深度呈正相关(OR=2.306，95%CI：1.136～3.548，P<0.05)，与CEA表达呈正相关(OR=2.115，95%CI：1.158～5.508，P<0.05)，与Hp表达呈正相关(OR=2.327，95%CI：1.479～4.638，P<0.05)。

外周血中PCDH17启动子甲基化与肿瘤分化程度呈正相关(OR=2.634，95%CI：1.336～4.008，P<0.05)，与淋巴结转移呈正相关(OR=2.967，95%CI：1.327～4.267，P<0.05)，与浸润深度呈正相关(OR=2.576，95%CI：1.436～3.007，P<0.05)，与CEA表达呈正相关(OR=2.658，95%CI：1.367～5.157，P<0.05)，与Hp表达情况呈正相关(OR=2.997，95%CI：1.856～5.435，P<0.05)，见表2。

表2 胃癌患者临床病理参数与血浆DNA甲基化的相关性分析/例

2.4 上皮内瘤变组患者临床病理参数与血浆DNA甲基化的相关性分析

结果显示，外周血中ELMO1和PCDH17启动子甲基化水平与上皮内瘤变组患者临床病理参数无明显相关性(P>0.05)，见表3。

2.5 肠上皮化生组患者临床病理参数与血浆DNA甲基化的相关性分析

结果显示，外周血中ELMO1和PCDH17启动子甲基化水平与肠上皮化生组患者临床病理参数无明显相关性(P>0.05)，见表4。

2.6 联合检测外周血中ELMO1和PCDH17甲基化对胃癌的诊断价值

结果显示，联合检测外周血中ELMO1和PCDH17甲基化后的约登指数和ROC曲线下面积也明显增加，高于任一单独指标或其他联合方式检测，见表5。

表3 上皮内瘤变组患者临床病理参数与血浆DNA甲基化的相关性分析/例

表4 肠上皮化生组患者临床病理参数与血浆DNA甲基化的相关性分析/例

表5 联合检测外周血中ELMO1和PCDH17甲基化对胃癌的诊断价值

3 讨论

胃癌是临床上的常见肿瘤类型之一，多于患者的饮食、生活习惯密切相关。而对于胃癌的诊疗中，最重要的治疗方法是早期诊断，早期治疗和早期预防。对于胃癌的早期诊断方法的探索中，血清学指标是临床上较为常用的方法之一。既往研究中，探究血清中胃蛋白酶原(PG)I、PGII和胃泌素-17(G-17)水平在萎缩性胃炎和胃癌筛查中的价值和临床适用性，从而为临床上胃癌的诊断和治疗提供思路[9]。也有研究探究血清中的lncRNA MIAT和lncRNA CCAT1在胃癌早期诊断中的应用，可以作为生物标志物存在[10-11]。但是，其特异性和敏感性欠佳。在本研究中，我们以血清中吞噬细胞运动蛋白1和原钙黏附蛋白17启动子甲基化水平作为研究切入点，探究其对胃癌早期诊断和早期治疗中的作用。

吞噬细胞运动蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)是指具有保守序列的一类蛋白质，与细胞的侵袭，迁移和吞噬密切相关。既往研究[12]中，他们认为肺癌细胞可以通过TGF-β信号通路介导ELMO1调控的肿瘤细胞的侵袭和凋亡。也有研究探讨ELMO1在三阴性乳腺癌(TNBC)上皮细胞迁移和侵袭中的作用和机制。利用细胞迁移和细胞侵袭试验，分别评估细胞活力、迁移和侵袭。结果表明，ELMO1的下调抑制了MDA-MB-231细胞的活力、迁移和侵袭，并降低了Rac1的活性，研究结果表明ELMO1通过RhoA/Rac1途径抑制TNBC上皮细胞的迁移和侵袭[13]。原钙黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)属于钙黏附蛋白超家族中的一员，可以发挥抑癌的作用。PCDH17的基因突变和甲基化改变与肿瘤的发生和发展密切相关，比如鼻咽癌，乳腺癌等。在本研究中，我们通过比较胃癌患者和癌周组织比较了肿瘤和正常组织之间的甲基化结果，发现吞噬细胞运动蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原钙黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)启动子甲基化水平变化最大。

DNA的甲基化改变是表观遗传学的常见类型之一，抑癌基因可以通过甲基化改变，基因的功能发生改变，从而进一步调控肿瘤细胞的侵袭和凋亡。既往研究中，抑瘤素M受体基因可以通过甲基化修饰，与胃癌患者的预后密切相关，可以作为生物靶向因子[14]。在本研究中，利用PCR琼脂糖检测胃癌患者，肠上皮化生，上皮内瘤变和对照组患血清中吞噬细胞运动蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原钙黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)的甲基化改变，结果表明，胃癌患者中吞噬细胞运动蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原钙黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)的甲基化水平明显升高。

此外，本研究还探究了胃癌患者中，吞噬细胞运动蛋白1(engulfment and cell motility 1,ELMO1)和原钙黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)的甲基化改变与临床资料的相关性，结果表明，外周血中ELMO1和PCDH17启动子甲基化情况与肿瘤的分化程度，淋巴结转移，浸润深度，CEA表达水平和Hp表达情况呈正相关(P<0.05)。分析原因，可能是肿瘤分化越差，淋巴结已经转移，浸润深度较高，CEA表达水平较高以及Hp阳性的患者外周血中ELMO1和PCDH17启动子甲基化水平明显升高，可以作为生物标志物而存在。此外，本研究还联合检测外周血中ELMO1和PCDH17甲基化对胃癌的诊断价值，结果表明，联合ELMO1和PCDH17启动子甲基化水平检测后，灵敏度和特异性明显升高，约登指数和ROC曲线下面积也明显增加。与朱春霞等[15]的研究结果相似，ELMO1和PCDH17的甲基化水平可以作为胃癌患者早期诊断的指标之一。

但是，本研究也存在一定的局限性，比如入组病例多为单中心病例，而且具体的作用机制尚未可知。因此，在本研究的后续工作中，将进一步完善该项工作。