淡水中总氮浓度简便、快速的测定方法与技术探究*

孙 巍 朱 颖 李长秀 陈心如 邝春议 卢勇杰 李嘉敬 韦明肯

(广东石油化工学院生物与食品工程学院，广东 茂名 525000)

总氮是水中无机氮(包括氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮)和有机氮的总和，是衡量水质富营养化的重要指标之一[1]。随着经济的发展和人口的快速增长，大量含氮废水被排入水体，导致水中有机氮和无机氮含量过高，微生物大量繁殖，出现富营养化状态[2]。因此，总氮的测定是当今水质监测的重要环境参数之一。

1 总氮测定方法

目前，淡水水体中主要的总氮测定方法及其优缺点比较见表1。

国标法是测定淡水中总氮含量的常用方法，原理简单、使用仪器简单、对实验室要求较低、应用较广泛，但该方法需要用到高压灭菌锅进行消解，操作繁琐且影响因素较多不易控制，使得测定结果准确度较低，给实验者带来较多困难；容易受到外界因素干扰，影响测定结果；反应体系过大、操作不方便导致不能满足样品批量测试，同时耗时长。其他5种测定方法检测准确、快速、灵敏，但需要依赖大型分析仪器，一般实验室难以普及应用。

表1 总氮的测定方法及其优缺点比较Table 1 Determination methods of total nitrogen and their advantages and disadvantages

基于HJ 636—2012，本研究拟采用15 mL消解管和总氮消解仪分别取代HJ 636—2012中的25 mL比色管和高压灭菌锅消解样品，建立一种小体系总氮测定的新方法(简称新方法)，探究新方法的影响因素，并将新方法与国标法进行比较，通过线性拟合、正交验证、F和t检验等验证新方法的精密性和准确性。

2 材料与方法

2.1 主要仪器与试剂

UV-1800PC紫外分光光度计；25 mL比色管；紧固式LX-B35L自控压力蒸汽灭菌锅；15 mL消解管；LH-25A智能多参数消解仪(340 mm×240 mm×214 mm，消解数量为25支，消解温度为45～190 ℃，额定电压为220 V)。

参照HJ 636—2012，配制(1+9)盐酸溶液、40 g/L碱性过硫酸钾溶液、10.0 mg/L硝酸钾标准使用液。

2.2 实验方法设计

2.2.1 影响因素优化实验

(1) 消解液用量：碱性过硫酸钾溶液变更为1.9、2.0、2.1、2.2、2.3 mL。

(2) 消解时间：消解时间变更为10、20、30、40、50 min。

(3) 水体盐度：工作液中加入不同浓度的氯化钠改变水体盐度为0、0.25%、0.50%、0.75%、1.50%，采用F检验进行验证。

(4) pH：工作液调节pH为1、3、5、7、9、11，采用F检验进行验证。

2.2.2 总氮标准曲线绘制及其拟合验证

根据2.2.1节确定的优化条件，参照HJ 636—2012绘制总氮标准曲线。新方法总氮标准曲线实验步骤：(1)分别量取0、0.1、0.2、0.4、1.2、2.8 mL硝酸钾标准使用液于15 mL消解管中，加超纯水稀释至4 mL，此时对应总氮分别为0、0.25、0.50、1.00、3.00、7.00 mg/L。(2)加入2.0 mL碱性过硫酸钾溶液，拧紧瓶盖，混匀。(3)将消解管置于消解仪中加热至120 ℃开始消解，在120～124 ℃保持30 min，冷却至室温后将瓶中液体颠倒混匀2～3次。(4)分别加入0.4 mL盐酸溶液，加超纯水稀释至10 mL标线，混匀。使用紫外分光光度计检测A220、A275，并计算总氮吸光度，绘制标准曲线。

对两种方法的总氮标准曲线进行线性拟合，且采用正交验证和t检验进行验证，以此证明新方法的可行性。

2.2.3 确定新方法的总氮线性测定范围

二要积极争取中央和省市补助资金，充分发挥政府及有关部门的职能作用，吃透上级政策，加强沟通协调，积极提报水利重点项目，做好项目前期工作，用优良的投入收益率和先进的项目理念，争取国家的项目投资和上级的政策支持。

在优化条件下，对工作液浓度范围进行扩大，分别设定工作液的总氮为0、0.25、0.50、1.00、3.00、7.00、11.00、12.00、13.00、14.00、20.00、25.00 mg/L，确定总氮线性测定范围。

2.2.4 实测环境样品的准确性验证

分别在广东省茂名市两个区域(茂南区(3个水样)和化州市(2个水样))采集并实测水样。水样采集完毕，送回实验室后放入冰箱保存。采用两种方法测定总氮浓度。由于部分样品总氮浓度较高，测定前需进行相应地梯度稀释。对水样的两种测定结果分别进行F、t检验，拟证明新方法的准确性。

3 结果与讨论

3.1 消解液用量的优化

在高温碱性介质下，碱性过硫酸钾将水中氨氮、亚硝酸盐氮和大部分有机氮氧化为硝酸盐，因此消解液用量是影响实验检验结果的重要因素。相同总氮浓度下，当消解液用量为1.9～2.0 mL时，吸光度呈上升趋势(见图1)，1.9 mL时吸光度较低的原因是碱性过硫酸钾不足，不能与水中含氮化合物完全反应，导致吸光度较低；当消解液用量为2.0～2.3 mL时，吸光度总体呈下降趋势，2.0 mL时吸光度达到峰值。因此，新方法的消解液用量最佳为2.0 mL。

图1 消解液用量对新方法总氮测定的影响Fig.1 Effect of the amount of digestion solution on the determination of total nitrogen by the new method

3.2 消解时间的优化

相同总氮浓度下，当消解时间为10～30 min时，吸光度总体呈上升趋势(见图2)，其原因是因为消解时间的延长使碱性过硫酸钾氧化底物更彻底；当消解时间为30～50 min时，吸光度总体呈下降趋势，但下降趋势不明显，整体稳定性较差。30 min时吸光度总体达到峰值，且该消解时间下的数据较稳定，因此消解时间最佳为30 min。

3.3 水体盐度的优化

水体盐度是影响总氮测定的重要因素之一。李碧莹等[13]研究表明，盐度小于0.4%的水体适用HJ 636—2012，而盐度大于1.8%的水体需用《海洋监测规范 第4部分：海水分析》(GB 17378.4—2007)，而盐度为0.4%～1.8%的养殖水体需将盐度稀释到小于0.4%再根据HJ 636—2012测定。因此，确定总氮测定适用的水体盐度范围有利于明确总氮测定的适用性，可以对水样进行适当的预处理，从而保证测定结果准确可靠。由图3可见，相同总氮浓度下，总体上，当水体盐度为0～0.5%时，吸光度呈下降趋势；当水体盐度大于0.5%时，吸光度呈上升趋势，且总氮浓度越高，增长幅度越大。由于整体数据波动幅度较小，需进行进一步显著性分析。经置信度为95%的F检验，水体盐度对新方法测定结果的F值为0.016，小于F检验临界值表中的2.759，说明水体盐度为0～1.5%对新方法测定结果不存在显著性差异，即新方法水体盐度范围较大，可适用于水体盐度较高的环境样品测定。与国标法相比，新方法对不同水体盐度的总氮测定的适用性也更明确。

图2 消解时间对新方法总氮测定的影响Fig.2 Effect of digestion time on the determination of total nitrogen by the new method

图3 水体盐度对新方法总氮测定的影响Fig.3 Effect of water salinity on the determination of total nitrogen by the new method

3.4 pH的优化

由图4可见，当总氮为0.25～1.00 mg/L时，pH对吸光度影响较低，整体数据较稳定；当总氮大于1.00 mg/L时，pH对总氮测定的影响增大。经置信度为95%的F检验，pH对新方法测定结果的F值为0.028，小于F检验临界值表中的2.524，说明pH对新方法测定结果不存在显著性差异。整体分析，当处于中性或碱性时，吸光度稳定性较好。综上所述，新方法最适pH范围应为中性或碱性。

图4 水体pH对新方法总氮浓度测定的影响Fig.4 Effect of water pH on total nitrogen concentration determination by new method

3.5 在优化条件下绘制标准曲线

综合确定优化条件为消解液用量2.0 mL、消解时间30 min、pH调至7以上。在优化条件下绘制新方法和国标法的标准曲线，相应的线性回归方程分别见式(1)和式(2)。可见，两种方法都具有很好的线性回归关系。为进一步确定新方法的准确性，采用正交验证法对两种方法进行交叉检验和线性拟合，得到的线性方程见式(3)，说明两种方法的测定结果高度一致。经置信度为95%的t检验，两种方法的Sig.=0.948>0.05，进一步证实两种方法不存在显著性差异，说明新方法可行性较高。

Y=0.046 8X-0.004，R2=0.999 8

(1)

Y=0.045 5X-0.002，R2=0.999 6

(2)

Y15=1.029 6Y25+0.002 3，R2=0.999 2

(3)

式中：Y为吸光度；X为总氮质量浓度，mg/L；Y15为新方法测定的吸光度；Y25为国标法测定的吸光度。

3.6 新方法线性测定范围

由图5可见，当总氮为0～11.00 mg/L时，总氮与吸光度呈线性关系，R2=0.999 7；当总氮超过11.00 mg/L时，吸光度增长幅度降低，线性相关系数下降，稳定性减弱。可确定新方法线性测定范围为0～11.00 mg/L，是HJ 636—2012(0～7 mg/L)的1.6倍。新方法明显提高了总氮的测定上线，可对较高的总氮浓度进行有效测定，节省了多梯度稀释所消耗的时间和成本。

图5 新方法总氮的线性测定范围Fig.5 Linear determination range of total nitrogen by the new method

3.7 实测环境样品的交叉验证

用两种方法分别检测茂名市茂南区和化州市的水样，并采用正交验证法进行比较，拟合结果见图6。两种方法测定结果拟合的R2=0.998 2，线性关系良好。

图6 新方法与国标法总氮测定结果的正交验证曲线Fig.6 Orthogonal validation curve between the new method and the national standard method for determination of total nitrogen

为进一步验证新方法的可行性，对两种测定结果分别进行F、t检验。经置信度为95%的F检验，新方法和国标法测定结果的F值为0.009，小于F检验临界值表中的5.318，说明两种方法不存在显著性差异。经置信度为95%的t检验，新方法和国标法测定结果的Sig.=0.928>0.05，进一步证实两种方法无显著性差异。综上所述，新方法测定淡水总氮浓度的准确度高，具有可行性。

4 结 语

水体总氮含量对于环境的影响越来越重要，常规总氮测定方法存在操作体积过大、消解困难、药品成本高等问题。本研究用15 mL消解管代替HJ 636—2012中的25 mL比色管，避免了溶液高温消解溢出或氨气溢出的现象，提高了线性关系，节省了检测时间，降低了药品成本。与国标法相比，新方法具有更好的水体盐度范围适用性，准确性和精密度高，总氮线性测定范围扩大到0～11.00 mg/L，可更有效测定较高总氮浓度的样品，节省稀释成本和时间。综上所述，新方法使总氮浓度的测定工作更简便、快速、准确，提高了工作效率，为实验室大批量测定淡水总氮浓度提供了可行性。