表没食子儿茶素没食子酸酯对丙泊酚诱发老年大鼠认知功能损伤的影响

刘文雄，高 敏

陕西省西安市西电集团医院麻醉科，陕西西安710077

丙泊酚是目前临床应用最为广泛的快速、强效全身麻醉剂，具有药效快速、麻醉平稳、苏醒快速等优点[1]。在临床上，丙泊酚以首次相对较高的剂量给药使患者失去意识，然后以较小的剂量连续输注，以保持患者无反应的镇静状态。但是丙泊酚具有一些药物不良反应，尤其是对神经系统的认知功能损伤最为突出[2]。研究发现，丙泊酚注射能够引起患者产生不同程度的认知功能损伤，其中以对儿童和老年人的认知功能损伤更为明显[3-4]。但是，目前临床上尚缺乏应对丙泊酚诱发的认知功能损伤的安全、有效的防治方法。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是一种抗炎和抗氧化剂多酚，主要存在于绿茶中。研究发现，EGCG对癌症、肥胖、高血糖、动脉粥样硬化和神经退行性疾病具有积极的治疗作用[5-6]。流行病学调查也证实了长期服用低剂量EGCG的生物安全性[7]。但是，目前国内外关于EGCG对丙泊酚诱发的认知功能损伤的影响及机制报道较少。本研究通过构建丙泊酚诱发的老年认知功能损伤大鼠模型，研究EGCG对该大鼠模型认知功能损伤的潜在治疗效果并探讨相关的作用机制。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 Morris水迷宫购自上海移数信息科技有限公司；病理切片机(型号RM2016)购自德国徕卡公司；激光扫描共聚焦显微镜(型号FV1200)购自日本奥林巴斯公司；双垂直电泳仪(型号DYCZ-24DN)购自北京六一仪器厂；酶标检测仪(型号Rt2100c)购自美国Rayto公司；凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；半干转膜仪(型号Trans-Blot SD System)购自美国Bio-Rad公司；丙泊酚注射液购自西安立邦制药有限公司；EGCG购自美国Apexbio公司；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自武汉华美生物公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、核因子κB(NF-κB)p65、磷酸化p65(p-p65)和GAPDH抗体购自美国Abcam公司；原位末端标记(TUNEL)凋亡荧光检测试剂盒购自美国Abcam公司。

1.2分组处理 36只雄性20月龄SPF级Sprague-Dawley大鼠，体质量405～430 g，购自成都达硕实验动物有限公司。全部实验动物随机等分为对照组、丙泊酚组和丙泊酚+EGCG组，每组12只。对照组大鼠腹腔注射生理盐水(5 mL/d)，丙泊酚组和丙泊酚+EGCG组腹腔注射丙泊酚60 mg/kg，每小时注射1次丙泊酚(注射剂量为首次剂量的一半)，维持麻醉6 h。每次麻醉后立即躺在自制的吸氧箱上，以5 L/min的流量持续供氧，待翻正反射恢复后，将大鼠从吸氧箱中取出。除实验时间外，大鼠可以自由进食和饮水。丙泊酚+EGCG组大鼠每天进行50 mg/kg的EGCG灌胃处理，连续治疗7 d。对照组和丙泊酚组的大鼠每天给予相同体积的生理盐水灌胃处理。

1.3Morris水迷宫实验 7 d的治疗结束后，采用Morris水迷宫实验评价3组大鼠的学习记忆能力。测试前，将平台放置在水迷宫东北象限的中心，高度在水面以下2 cm处。在池子里加入适量的墨水，使动物无法分辨平台。游泳池的墙上挂着几个物体作为参考。将水温加热至24～26 ℃，进行定位导航试验5 d。每天分为2个时段，每时段4次训练。在4次训练中，将大鼠分别置于不同象限的水中，用秒表记录大鼠找到平台前的持续时间(逃逸潜伏期)。两次训练间隔1 min。第5日下午进行探索实验。平台被移走，动物们被从西南象限放入水中，使用摄像机记录大鼠在迷宫里2 min内的游泳距离和穿越平台次数。

1.4大鼠海马组织炎症因子和神经营养因子水平检测 Morris水迷宫实验结束后，立即使用过量戊巴比妥钠腹腔注射处死各组大鼠。随后，对大鼠开颅提取海马组织，将海马组织等分为3份，分别用于ELISA、组织切片染色和蛋白质印迹法(Western blot)检测。使用生理盐水(1∶10)快速制备匀浆，3 000 r/min离心10 min，获得上清液。采用ELISA试剂盒检测海马组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)水平。全过程严格按照试剂盒中说明书操作步骤执行。

1.5大鼠海马组织TUNEL荧光染色 对提取的大鼠海马组织进行4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，病理切片机下进行组织切片，二甲苯和梯度酒精中脱蜡。采用TUNEL工作液将组织切片进行孵育，37 ℃避光1 h，随后采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚复染，37 ℃避光1 h，封片后在激光共聚焦显微镜下进行图像采集和数据分析。

1.6大鼠海马组织蛋白的Western blot检测 将大鼠海马组织在玻璃研磨机中充分研磨，随后加入1 mL细胞裂解液裂解30 min，然后以2 000 r/min离心5 min，获取上清液，使用BCA法对蛋白水平进行测定。随后以4∶1比例上样，煮沸后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜及封闭后，分别使用Caspase-3、NF-κB p65、NF-κB p-p65的一抗进行过夜孵育，充分漂洗后孵育二抗，进行显影和蛋白水平的半定量分析。以GAPDH作为内参。

2 结 果

2.1EGCG对丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠学习记忆能力的影响 与对照组比较，丙泊酚组大鼠的逃逸潜伏期和游泳距离增加，穿越平台次数减少(P<0.05)；与丙泊酚组比较，丙泊酚+EGCG组大鼠的逃逸潜伏期和游泳距离减少(P<0.05)，穿越平台次数增加(P<0.05)；对照组与丙泊酚+EGCG组大鼠在逃逸潜伏期、游泳距离和穿越平台次数上比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 EGCG对丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠学习记忆能力的影响

2.2EGCG对丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠海马组织炎症因子水平的影响 与对照组比较，丙泊酚组大鼠海马组织中TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；与丙泊酚组比较，丙泊酚+EGCG组大鼠海马组织中TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05)；对照组与丙泊酚+EGCG组大鼠海马组织中TNF-α、IL-6水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 EGCG对丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠海马组织炎症因子水平的影响

2.3EGCG对丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠海马组织神经营养因子水平的影响 与对照组比较，丙泊酚组大鼠海马组织中NGF、BDGF水平降低(P<0.05)；与丙泊酚组比较，丙泊酚+EGCG组大鼠海马组织中NGF、BDGF水平升高(P<0.05)；对照组与丙泊酚+EGCG组大鼠海马组织中NGF、BDGF水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 EGCG对丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠海马组织神经营养因子水平的影响

2.4EGCG对丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠海马组织细胞凋亡的影响 与对照组比较，丙泊酚组大鼠海马组织细胞凋亡比例升高(P<0.05)；与丙泊酚组比较，丙泊酚+EGCG组大鼠海马组织细胞凋亡比例降低(P<0.05)。见表4。与对照组比较，丙泊酚组大鼠海马组织中凋亡因子Caspase-3水平、NF-κB p-p65/p65升高(P<0.05)；与丙泊酚组比较，丙泊酚+EGCG组大鼠海马组织中Caspase-3水平、NF-κB p-p65/p65降低(P<0.05)；丙泊酚组与丙泊酚+EGCG组大鼠海马组织Caspase-3水平、NF-κB p-p65/p65比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表5。

表4 EGCG对丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠海马组织细胞凋亡的影响

图1 EGCG对丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠海马组织细胞Caspase-3和NF-κB通路蛋白表达的影响

表5 EGCG对丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠海马组织细胞Caspase-3和NF-κB通路蛋白的影响

3 讨 论

由于EGCG具有抗氧化和抗炎反应特性，因此近年来它广泛被用于疾病的防治。EGCG的抗癌作用已在多种肿瘤细胞中得到证实[8]。EGCG已被证实能抑制癌变的诸多过程，如启动、促进和进展。此外EGCG还被证实能调节多种肿瘤细胞信号通路，如增殖、凋亡、血管生成和迁移等[9]。EGCG也被证实能产生抗肥胖和抗高血糖效应，学者们发现EGCG能抑制脂肪细胞生长和诱导脂肪细胞凋亡[10-11]。研究也发现EGCG能够对阿尔兹海默病等神经退行性疾病产生积极影响[12]。

丙泊酚是临床手术常见的麻醉药物，故它的药物不良反应也备受关注。研究发现丙泊酚麻醉后会产生不同程度的认知功能损伤，而其损伤程度与年龄相关[13]。本研究通过Morris水迷宫实验发现一次性注射丙泊酚7 d后大鼠的逃逸潜伏期和游泳距离增加，而穿越平台次数减少，提示丙泊酚可诱发大鼠学习记忆能力降低，表明大鼠认知功能损伤模型构建成功。本研究进一步发现连续7 d EGCG治疗可减少丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠的逃逸潜伏期和游泳距离，并增加其穿越平台次数，提示短期的EGCG治疗即可对丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠的学习记忆能力产生显著的改善效果。

海马区炎症反应是认知功能损伤的重要因素，降低海马区炎症因子水平也是改善认知功能的重要手段[14]。研究发现，丙泊酚能诱导海马组织处于高炎症反应状态[15]。本研究发现，TNF-α和IL-6是两个最常见的促炎因子，其在丙泊酚注射后的老年大鼠海马组织中处于高水平状态。而经EGCG治疗的丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠海马组织中TNF-α和IL-6水平接近对照组水平，提示EGCG能抑制丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠海马组织高炎症反应。本研究结果表明，EGCG对丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠的学习记忆能力的改善与其对海马组织的抗炎症反应有关。

NGF是中枢和外周神经细胞生长和发育不可或缺的因子，而NGF既可对海马组织的结构和功能发挥关键调控作用，且NGF也被认为是认知功能损伤的重要标志物[16]。BDGF也是神经营养素家族的关键成员。与NGF相比，BDGF主要局限于中枢神经系统，它支持来自神经嵴和外胚层基板的初级感觉神经元的存活，这些神经元对NGF没有反应[17]。研究也发现，海马组织中NGF和BDGF水平与认知功能呈高度线性正相关[18]。本研究发现丙泊酚注射的老年大鼠海马组织中NGF和BDGF水平降低，进一步证实了丙泊酚通过诱导海马组织损伤引发老年大鼠认知功能损伤。而丙泊酚+EGCG组大鼠海马组织中NGF和BDGF水平高于丙泊酚组，提示EGCG治疗后丙泊酚对海马组织的损伤效应显著减弱。

海马组织中凋亡细胞的进行性增多是认知功能损伤的关键诱因[19]。本研究发现丙泊酚组海马组织凋亡细胞比例高于对照组，而Western blott结果也发现Caspase-3作为凋亡诱导因子和细胞凋亡标志物，在丙泊酚组大鼠海马组织中水平升高，进一步证实了丙泊酚能够诱发海马组织细胞凋亡。EGCG治疗不仅可降低大鼠海马组织中凋亡的细胞数量，并且可降低海马组织中Caspase-3水平，提示EGCG对丙泊酚诱发的认知功能损伤的治疗效果与其对海马组织细胞凋亡的抑制有关。

研究表明所有促炎因子的基因都包含NF-κB结合位点，并受其转录调控[20]。NF-κB是转录因子Rel家族的一员，是由p50和p65亚基组成的异二聚体。不活跃的NF-κB复合物通过与抑制亚单位IκB结合而被隔离在细胞质中。在外界刺激下，IκB蛋白被磷酸化、泛素化和降解，使NF-κB转运到细胞核，在核内结合位于靶基因启动子区的特定DNA序列并激活基因转录。研究表明NF-κB的激活伴随着促炎症细胞因子的分泌，与阿尔茨海默病等诸多神经退行性病变有关，而通过药物抑制NF-κB水平可以有效缓解神经炎症从而改善认知功能[21]。本研究发现丙泊酚会诱发老年大鼠海马组织中NF-κB p-p65/p65升高，而EGCG治疗后丙泊酚诱发的NF-κB p-p65/p65被明显抑制，提示EGCG对丙泊酚诱发的认知功能损伤大鼠海马组织细胞的抗炎效应与其对NF-κB水平抑制有关。

综上所述，本研究揭示了EGCG可有效缓解丙泊酚诱发老年大鼠认知功能损伤，而该效应与NF-κB介导的海马组织细胞炎症反应和凋亡的抑制及神经营养因子活化有关。