樱桃采后灰霉病菌对甲基硫菌灵、乙霉威和腐霉利的抗性

宋郝棋, 杨晓琦, 李阿根, 吴鉴艳, 张传清*,

(1. 浙江农林大学 现代农学院，杭州 311300；2. 杭州市余杭区农业生态与植物保护管理总站，杭州 311100)

中国是主要的樱桃Prunus avium生产国和消费国[1-2]。灰霉病是樱桃的主要病害之一，由半知菌类葡萄孢属Botrytisspp.真菌侵染所致，可为害樱桃的花、叶、果实等多个部位[3]。葡萄孢属真菌腐生性较强而寄生性弱，故灰霉病多发生在樱桃收获后。灰霉病菌生长过程中，消耗了樱桃果实内大量的糖、有机酸等营养物质，从而致使果实品质下降，带来严重的经济损失。樱桃灰霉病常发生在果实运输或贮藏过程中，由于机械摩擦造成伤口和不合理的保鲜贮藏方式，果实表面初期长出白色霉层，表面形成圆形或近圆形病斑，霉层逐渐变灰色长出菌丝，生长后期变深灰色，并产生大量分生孢子[4]。

由于无抗病品种，生产中对灰霉病的防治多依赖于化学药剂。但由于病菌环境适应性和繁殖能力强，后代群体数量大，容易对化学药剂产生抗药性[5-6]，如病菌对二甲酰亚胺类杀菌剂的抗药性呈现上升趋势，但主要为低抗菌株。甲基硫菌灵、多菌灵等属于苯并咪唑类杀菌剂 (benzimidazole fungicides, BENs)，这类杀菌剂作用于真菌β-微管(β-tubulin)蛋白，通过抑制孢子芽管分隔和菌丝生长达到杀菌效果[7]。大部分的研究结果显示，病原真菌对苯并咪唑类药剂产生抗性的主要原因是β-tubulin 蛋白的点突变，主要为第198 位谷氨酸(E198A/G/K/V)[7]和200 位苯丙氨酸 (F200Y) 的不同点突变使病原菌对多菌灵等苯并咪唑类药剂产生不同程度的抗性[8-10]。很多苯并咪唑类杀菌剂的高抗菌株，会对乙霉威表现出负交互抗药性，所以乙霉威经常被用于甲基硫菌灵、多菌灵等的抗药性治理[9-10]。腐霉利等二甲酰亚胺类杀菌剂(dicarboximide fungicides, DCFs)，是一类广谱治疗型杀菌剂，是灰葡萄孢的特效杀菌剂，因此被大量用于果蔬等农作物的灰霉病防治。但随着该药剂的长期大量使用，灰霉病菌对其的抗性问题也日益严重[11]。Leroux 于1977 年首次得到了抗二甲酰亚胺类杀菌剂的灰葡萄孢菌突变体。20 世纪80年代初，德国和法国的葡萄园中已有60%～80%的菌株对二甲酰亚胺类杀菌剂产生了抗性[12]。Leroux等认为，灰葡萄孢田间抗性菌株在其双组分组氨酸激酶基因编码的第 365 位氨基酸发生了突变，可能与真菌的渗透调节有关[12]。前人对灰葡萄孢菌野生敏感菌株和抗二甲酰亚胺类药剂菌株的双组分组氨酸激酶基因 (BOS1) 进行比较发现，BOS1基因上的氨基酸点突变I365S/N、V368F、Q369H、T447S、Q369P、N373S 和1 040 位的缺失都可以引起灰霉病菌对DCFs 的抗性[10,13]。本研究主要对山东烟台、四川汉源两个地区的红灯、黑珍珠两个品种的甜樱桃进行采后贮藏期果实上的灰霉病菌进行分离纯化，测定菌株对甲基硫菌灵、乙霉威和腐霉利的敏感性，分析其抗性分子机制，明确樱桃灰霉病菌的抗药性发展情况，旨在为生产上灰霉病菌对多菌灵、乙霉威和腐霉利的抗性治理提供依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试樱桃：2020 年5 月分别于山东烟台、四川汉源采集樱桃健康果实用于采后病原菌的分离纯化及抗药性测定。

药剂及培养基：98.5% 甲基硫菌灵 (thiophanatemethyl，Thi) 原药、99.1% 乙霉威 (diethofencarb，Die)原药和95%腐霉利 (procymidone，Pro) 原药，均由浙江农林大学杀菌剂与植物病害治理实验室保存。原药均溶于丙酮中制成10 μg/mL 的母液保存于4 ℃冰箱中备用。马铃薯葡萄糖琼脂 (potato dextrose agar，PDA) 培养基，用于病菌的分离纯化及对药剂的敏感性测定。

试剂及仪器：PCR 扩增试剂盒2 × Taq PCR Mix、DNA 提取试剂盒，生工生物工程 (上海) 股份有限公司；其余试剂均为国产分析纯。MJ-150I 型霉菌培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；ABI2720 PCR 仪，美国Bio-Rad 公司；Scope.A1 型光学显微镜，德国卡尔·蔡司公司。

1.2 樱桃采后灰霉病菌的分离

于2020 年5 月收集山东烟台的红灯、黑珍珠甜樱桃和四川汉源的黑珍珠甜樱桃，果实采收后放入内衬软垫和冰袋的泡沫箱，冷链运输至实验室。挑选大小和成熟度基本一致、无病虫害和机械损伤的健康果实按一定顺序放进塑料保鲜盒中并对果实进行标号，在室温条件下进行病原菌保湿培养。待果实上病菌长出菌丝后，挑取菌丝转接到60 mm × 60 mm 的PDA 平板上，23 ℃黑暗条件下培养 3 d。待长出菌落后，将其纯化转接至90 mm × 90 mm 的PDA 平板上。采用单孢分离法[14]获得单孢菌株，依据地名/品种名缩写 (YTHD/SCHY/HZZ) + 果实编号 + 序号原则对其进行命名，如YTHD-2、HZZ-12-1 和 SCHY-1-2。经形态学鉴定后，使用冻存管保存供试菌株，置于 4 ℃冰箱保存备用。

1.3 樱桃采后灰霉病菌的鉴定

将纯化后的菌株接种于PDA 平板上，黑暗条件下25 ℃培养3 d 后，待菌落长至平板2/3，用接种针挑取少量菌丝体制作玻片，显微镜下依据病菌的分生孢子、分生孢子梗形态进行形态学鉴定[4]。将供试菌株在PDA 平板上于25 ℃黑暗条件下培养5 d 后，刮取菌丝，使用CTAB 法提取病原菌DNA。随后采用真菌 ITS 通用引物Its-1F/Its-4 进行PCR 扩增 (表1)[15]。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物。将PCR 产物目的条带纯化回收后送有康生物科技 (杭州) 有限公司测序，所得的菌株ITS 序列在NCBI 网站上进行碱基序列比对，结合形态学特征判断分离菌株种类。

表1 本研究PCR 扩增所用引物及其序列信息Table 1 Primers and their sequence information used in this study

1.4 樱桃采后灰霉病菌的抗药性检测

采用区分剂量法[16]测定各菌株对甲基硫菌灵、乙霉威和腐霉利的抗性。将供试菌株活化培养3 d后，用灭菌枪头 (直径 5.0 mm) 沿菌落边缘打孔，挑取菌饼分别接入含5 μg/mL 甲基硫菌灵 (Thi)、5 μg/mL 乙霉威 (Die) 和5 μg/mL 腐霉利 (Pro) 的含药培养基上，以不含药且含等量丙酮的 PDA 平板为对照，每处理设置3 个重复。23 ℃黑暗条件下培养 3 d 后观察菌落的生长情况。以CK 为对照，在CK 上能生长，在5 μg/mL Thi 上不能生长，在5 μg/mL Die 上能生长的菌株为苯并咪唑类杀菌剂敏感菌株 (BEN S)；在5 μg/mL Thi 上能生长，在5 μg/mL Die 上不能生长的菌株为苯并咪唑类杀菌剂抗性菌株 (BEN R1)；在5 μg/mL Thi 上能生长，在5 μg/mL Die 上也能生长的菌株为甲基硫菌灵-乙霉威双重抗性菌株 (BEN R2)；在CK 上能生长，在5 μg/mL Pro 上不能生长的菌株为二甲酰亚胺类杀菌剂敏感菌株 (DCF S)，在5 μg/mL Pro 上能生长即为二甲酰亚胺类杀菌剂抗性菌株(DCF R)。按照公式 (1) 计算抗药性频率 (R)[18]。

式中：N1为抗药性菌株数，N为菌株总数。

1.5 樱桃采后灰霉病菌对甲基硫菌灵和乙霉威的抗性机制分析

基于1.4 节抗性检测结果，随机选取12 株BEN S/R1/R2 菌株在PDA 平板上25 ℃黑暗条件下培养5 d 后，刮取菌丝，参照1.3 节方法提取菌株的基因组DNA。用引物对P1/P2 (表1) 扩增灰葡萄孢β-tubulin基因全长 (基因登录号：U27198.1)，所用引物由南京金瑞生物科技有限公司合成。PCR反应条件为，50 μL PCR 扩增体系：2 × Taq PCR Master Mix 25 μL、10 μmol/L 上下游引物各2 μL、ddH2O 20 μL、DNA 模板1 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸110 s，共 34 个循环，72 ℃延伸10 min[17]。PCR 扩增产物送至杭州有康生物有限公司进行测序。测序结果由DNAMAN 9.01生物软件进行分析，并对不同敏感性菌株的βtubulin基因序列进行比对，分析β-tubulin基因突变情况。

1.6 樱桃采后灰霉病菌对腐霉利的抗性机制分析

基于1.4 节抗性检测结果，随机选取8 株DCF S/R 菌株在PDA 平板上25 ℃黑暗条件下培养5 d 后，刮取菌丝，参照1.3 节方法提取菌株的基因组DNA。根据灰葡萄孢组氨酸激酶基因BcOS1序列 (基因登录号: AF396827.2)，参考杜颖的方法[16]合成 4 对引物 (表1)，用于扩增BcOS1基因全长，所用引物由南京金瑞生物科技有限公司合成。BcOS1基因片段的 PCR 反应条件为，50 μL PCR 扩增体系：2 × Taq PCR Master Mix 25 μL、10 μmol/L 上下游引物各2 μL、ddH2O 20 μL、DNA 模板1 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min、94 ℃变性30 s，按各引物相应的最佳退火温度退火30 s，72 ℃分别延伸110、60、50、100 s，共34 个循环，延伸时间根据各引物相应基因片段长度设置，每500 bp 延伸30 s，最后72 ℃延伸10 min[14]。将PCR 扩增产物送至杭州有康生物有限公司进行测序。测序结果由DNAMAN 9.01 生物软件进行分析，并对不同敏感性菌株的BcOS1基因序列进行比对。

2 结果与分析

2.1 樱桃采后灰霉病菌的分离

本研究从采自2 个地区、2 个品种共135 个甜樱桃健康果实表面共分离得到灰葡萄孢单孢菌株54 株，其中烟台红灯1 株，烟台黑珍珠2 株，汉源黑珍珠51 株。甜樱桃健康果实保湿培养3 d后，果实表面初期长出白色霉层，表面形成圆形或近圆形病斑，霉层逐渐变灰色长出菌丝，生长后期变深灰色，并有分生孢子产生。除灰霉病菌，本研究还从保湿培养3 d 后的甜樱桃健康果实分离得到少量互生链格孢Alternaria alternata、美澳型果生链核盘孢Monilinia fructicola、亚洲镰刀菌Fusarium asiaticum、类壳小圆孢Paraconiothyrium brasiliense、球状茎点霉Phoma glomerata、裂褶菌Schizophyllum commune等真菌。

2.2 樱桃采后灰霉病菌的形态特征

经过分离纯化的樱桃灰霉病菌在 PDA 平板上生长速度较快， 3 d 左右可长满平板(图1)；菌丝初期为灰白色，后期呈灰褐色；气生菌丝蓬松，绵软，絮状。生长后期在平板上出现形状不规则、大小不一的灰褐色菌核；菌落背面无色素沉积，颜色与正面相同；有发霉气味。分生孢子梗为灰褐色，有隔膜，顶端膨大，其上着生大量分生孢子，形似葡萄穗状；分生孢子为单孢，近圆形或椭圆形，无色或淡色。形态学鉴定与报道一致[19]，所获得菌株均为灰葡萄孢B.cinerea。

图1 樱桃灰霉病菌——灰葡萄孢的形态学特征Fig.1 Morphological characteristics of B. cinerea causing postharvest grey mold of cherry

2.3 樱桃采后灰霉病菌的分子生物学鉴定

利用通用引物ITS-1F 和ITS-4 扩增所得的54 株灰霉病菌ITS 序列的大小不完全相同，大小在545～580 bp。将测序结果在NCBI 网站上进行碱基序列比对， 54 株病菌均与灰葡萄孢B.cinerea(登录号：KT723007.1、MZ148644.1 和 KX192368.1等) 同源性在98%以上[19-20]。

2.4 樱桃采后灰霉病菌的抗药性检测

供试菌株对甲基硫菌灵的总抗性频率高达79.6%，其中苯并咪唑类杀菌剂抗性菌株 (BEN R1)14 株，频率为 25.9%；甲基硫菌灵-乙霉威双重抗性菌株 (BEN R2) 29 株，频率为53.7% (图2-a)。检测到二甲酰亚胺类杀菌剂腐霉利抗性菌株 (DCF R)9 株，抗性频率为16.7% (图2-b)。

图2 樱桃采后灰霉病菌对甲基硫菌灵、乙霉威 (a) 和腐霉利 (b) 的抗性频率Fig.2 Resistance of B.cinerea to thiophanate-methyl, diethofencarb (a) and procymidone (b) on postharvest cherry

2.5 樱桃采后灰霉病菌对甲基硫菌灵和乙霉威的抗性机制分析

扩增获得了随机选取的12 株不同敏感性类型的樱桃灰霉病菌菌株的β-tubulin序列。比对发现，抗性菌株与敏感菌株在198 位密码子存在差异 (表2)。所有供试苯并咪唑类杀菌剂敏感菌株(BEN S) 中，第198 位密码子为GAG，编码Glu(E)。在BEN R1 抗性菌株中，第198 位密码子发生了突变，由GAG 突变成GCG，导致编码的氨基酸由Glu (E)突变成Ala (A)。在BEN R2 抗性菌株中， 198 位密码子由GAG 突变成GTG，导致编码的氨基酸由Glu (E)突变成Val (V)。

表2 不同灰葡萄孢β-tubulin 碱基序列及氨基酸的比较Table 2 Comparison of codon and encoded amino acid sequences of β-tubulin from different isolates

2.6 樱桃采后灰霉病菌对腐霉利的抗性机制分析

扩增获得了随机选取的12 株不同敏感性类型的樱桃灰霉病菌菌株BcOS1的碱基序列。比对发现，抗性菌株与敏感菌株在365 位密码子存在差异 (表3)。所有供试二甲酰亚胺类杀菌剂敏感菌株(DCF S) 的BcOS1基因未检测到突变位点的存在，而在二甲酰亚胺类杀菌剂抗性菌株 (DCF R)中则检测到1 个突变位点，即BcOS1基因的第365 位密码子，由ATC 突变成AAC 或AGC，编码的氨基酸由Ile (I)突变成Asn (N)或Ser (S)，导致菌株产生了抗药性。

表3 不同灰葡萄孢 BcOS1 碱基序列及氨基酸的比较Table 3 Comparison of the codon and encoded amino acid sequences of BcOS1 from different strains

3 讨论与结论

灰霉病是影响樱桃产量和品质的主要病害之一。本研究对甜樱桃健康果实进行培养，通过病原菌的分离、纯化，结合病原菌的形态学特征以及分子生物学鉴定，确定樱桃采后灰霉病菌菌株均为B.cinerea。据报道，B.cinerea可侵染草莓、番茄、多种不同植物，通过侵入植物花、叶片和果实等多个部位，导致腐烂，影响产量带来严重的经济损失。李肖静[21]研究表明，B.cinerea可在草莓贮藏运输途径中致使果实破损，使草莓采后短时内果实变质。纪明山等[22]发现，灰霉病是辽宁各地番茄的多发性病害，不仅侵染番茄果实，也侵染番茄的叶、茎、花，使番茄严重减产减收。樱桃采后保鲜技术包括3 个方面：物理保鲜(低温、冷激、气调和辐照等)、 化学保鲜 (二氧化氯、乙醇、醋酸、氯化钙和 1-甲基环丙烯等) 和生物保鲜 (植物提取物、壳聚糖、精油、酚类物质和酵母菌等)，其中低温冷藏和气调是主要处理方式[2]。目前，樱桃采后灰霉病的防治主要依赖施用杀菌剂和生物防治控制采后病原菌数量。室温下500 μL/L乙醇薰蒸甜樱桃12 h，可有效抑制灰霉病、延缓果实软化和可滴定酸的下降[23]。生物防治主要集中在酵母的研究上，然而单独使用保鲜效果不稳定。因此，有研究人员将这种生物方法与物理方法结合处理甜樱桃，发现采用60 ℃热水喷淋“先峰”20 s 后，再在罗伦隐球酵母菌液中浸泡2 min可有效抑制甜樱桃果实灰霉病[24]。

目前在樱桃生产过程中，采前针对灰霉病防治主要以化学防治为主，常使用甲基硫菌灵等苯并咪唑类杀菌剂、二甲酰亚胺类杀菌剂和苯氨基嘧啶类杀菌剂等来进行[25]。由于灰葡萄孢繁殖能力强以及长时间单一药剂的使用，致使灰葡萄孢对某些杀菌剂普遍产生抗药性，防治难度提高。据报道，苯并咪唑类杀菌剂与二甲酰亚胺类杀菌剂的抗性问题日益突出[26-27]。本研究进行了樱桃采后灰霉病菌对甲基硫菌灵、腐霉利的抗性检测，结果同样发现有较高水平抗性的现象。在灰霉病的防治中，最常使用的苯并咪唑类杀菌剂是甲基硫菌灵，而β-tubulin基因的点突变是使病原菌产生抗性的主要原因[28]，利用分子诊断方法可以有效监测田间灰霉病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性。本研究表明，苯并咪唑类杀菌剂抗性菌株在β-tubulin基因上的突变共有2 种突变类型：第I 类为E198A，第II 类为E198V。Oshima 等[29]研究表明，主要由于BcOS1基因片段的改变引起灰葡萄孢对二甲酰亚胺产生抗性：灰葡萄孢抗二甲酰亚胺类杀菌剂突变菌株分为3 种突变类型：第I 类为I365S，第II 类为I365N，第III 类为Q369P +N373S，且其中第III 类Q369P + N373S突变导致灰霉病菌对腐霉利产生中等水平抗性。郑远等[14]也报道了I365S 或I365N 突变会导致灰霉病菌对腐霉利产生低或中等水平抗性；Q369P + N373S突变导致灰霉病菌对腐霉利产生高水平抗性。本研究则在BcOS1基因上检测到抗性菌株中的I365S/N突变。

樱桃采后灰霉病菌对苯并咪唑类杀菌剂产生了严重的抗性，不宜再单一使用该类杀菌剂；对二甲酰亚胺类杀菌剂已经出现抗性，要在加强抗药性监测的同时与其他类型杀菌剂交替使用，延缓抗药性发展。