非衍生化超高效液相色谱-串联质谱法快速检测环境水中强极性农药及其代谢物

方 灵, 史梦竹, 司瑞茹, 韦 航, 梁启富, 傅建炜

(福建省农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所/福建省农产品质量安全重点实验室 福州 350003)

乙烯利是一种植物生长调节剂，具有调节植物生长、促进果实成熟等作用，广泛应用于果蔬催熟领域。研究表明，乙烯利具有神经毒性，对免疫和生殖系统造成一定损害[1]。草甘膦 和草铵膦 作为非选择性、内吸性及水溶性除草剂，具有高效、价廉等优点，广泛应用于农业、林业等领域[2]。草甘膦主要代谢产物为氨甲基膦酸 ，草铵膦在环境中主要降解为3-(甲基磷酸亚基)丙酸及草铵膦-N-乙酰 ，草甘膦及草铵膦主要通过抑制胆碱酯酶活性，对神经系统造成不良影响[3]。乙烯利、草甘膦、草铵膦及其代谢物等通过食物链、生物富集，对人类身体健康产生潜在的影响，同时对生态环境也产生一定的风险。乙烯利、草甘膦、草铵膦及其代谢物均为强极性化合物 (化学结构式见图式1)，含有膦酸基团，这些化合物通常不溶于大部分有机溶剂，难挥发[4]，导致其残留分析难度大大增加。

图式1 6 种化合物化学结构Scheme 1 Chemical structures of six compounds

目前，针对乙烯利、草甘膦、草铵膦等强极性化合物的检测方法有气相色谱-质谱法[5-6]、液相色谱-质谱法[7-9]、气相色谱法[10-11]、液相色谱法[12-13]和离子色谱法[14-15]等。虽然离子色谱法可以直接检测极性化合物，但抗干扰能力较差，易产生“假阳性”结果[16]。气相色谱-质谱法、气相色谱法及液相色谱法通常需要衍生化反应，前处理操作相对复杂、繁琐，方法重现性较差，效率较低[17]。液相色谱-质谱法具有灵敏度高、分析效率高、选择性高等特点，成为当前乙烯利、草甘膦、草铵膦等强极性化合物痕量分析的主要方法。现有的大部分方法是通过芴甲氧羰酰氯 (FMOC-Cl) 试剂衍生[18-21]。草甘膦、草铵膦等在硼酸盐缓冲溶液中与FMOC-Cl 试剂混匀后室温下反应2 h，形成的衍生产物FMOC-Gly、FMOC-Glu 等易溶于水，可采用常规C18柱对产物进行分离分析[7]，但操作繁琐，重现性较差。也可使用亲水性色谱柱 (HILIC)进行分离[22-23]，但亲水色谱柱平衡时间较长，草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸等物质峰形易拖尾，从而影响准确定量[1]。目前，关于环境水中乙烯利、草甘膦、草铵膦及其代谢物等6 种强极性化合物同时测定的方法尚未见报道。基于现有方法的局限性，有必要建立一种高效、便捷、灵敏的环境水中乙烯利、草甘膦、草铵膦等6 种极性化合物的检测技术。

草甘膦、草铵膦等强极性农药具有较强的金属络合能力，而仪器管路系统中存在微量金属，导致目标物响应强度降低，峰形异常。为了改善这些极性物质的峰形及提高目标物信号响应强度，考察了一种新型流动相添加剂——亚甲基二膦酸在不同浓度下对待测目标物的影响，以及6 种化合物在进样系统中的残留水平。本研究利用反相色谱柱，建立了一种非衍生化超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）直接测定环境水样中乙烯利、草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸、3-(甲基磷酸亚基）丙酸及草铵膦-N-乙酰等6 种强极性化合物的分析方法，以期为相关监管部门监测环境水中上述化合物提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Shimadzu LCMS-8050 超高效液相色谱-串联质谱仪 (日本岛津公司)；Allegra X-30R 冷冻离心机 (美国Beckman Coulter 公司)；涡旋振荡器 (德国IKA 公司)；Milli-Q 超纯水器 (美国Millipore公司)。

草甘膦 (glyphosate，纯度99.9%)、草铵膦(glufosinate，纯度98.9%)、氨甲基膦酸 (aminomethylphosphonic acid，纯度99.5%)、3-(甲基磷酸亚基)丙酸(3-methylphosphinicopropionic acid，纯度98.4%)、草铵膦-N-乙酰 (glufosinate-N-acetyl，纯度98.3%)及乙烯利 (ethephon，纯度99.0%) (100 μg/mL，天津阿尔塔科技有限公司)；亚甲基二膦酸 (纯度97%，百灵威科技有限公司)。

甲醇 (色谱纯，德国Merck 公司)；甲酸 (色谱纯，上海麦克林公司)；乙酸铵 (色谱纯，美国Fish Chemical 公司)；水相针式滤器 (0.22 μm，聚醚砜，上海安谱实验科技股份有限公司)；试验用水为超纯水。

1.2 标准溶液配制

准确量取各标准品溶液，用超纯水混匀并定容，配制成质量浓度为10 mg/L 的混合标准储备液，于4 ℃下密闭保存于聚丙烯容器。准确移取一定量的混合标准储备液，用超纯水稀释，配制成质量浓度为1、5、10、20、50、100、200 和500 μg/L 的系列标准工作溶液，现配现用。

1.3 样品前处理

量取5 mL 环境水样于15 mL 聚丙烯离心管中，于4 ℃、5 000 r/min 下离心5 min。取上清液，过0.22 μm 水相针式滤器，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 色谱与质谱检测条件

1.4.1 液相色谱条件 Waters Acquity UPLC HSS T3 色谱柱 (100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)；流速：0.20 mL/min；柱温40 ℃；进样量10.0 μL。流动相A 为0.1% 甲酸-5 μmol/L 亚甲基二膦酸水溶液；B 为甲醇，梯度洗脱程序：0～4.0 min，95%A；＞ 4.0～4.1 min，95%～20%A；＞ 4.1～6.0 min，20%A；＞ 6.0～6.1 min，20%～95% A；＞ 6.1～9.0 min，95%A。峰面积外标法定量。

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源 (ESI)；多反应监测模式 (MRM)；雾化气流量3 L/min；加热气流量10 L/min；干燥气流量10 L/min；接口温度300 ℃；脱溶剂管 (DL) 温度250 ℃；加热块温度400 ℃。其他质谱参详见表1。

表1 6 种化合物的质谱信息参数Table 1 The MS parameters of the six compounds

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

2.1.1 色谱柱选择 根据6 种化合物的性质，考察了3 种色谱柱的分离效果。Waters Acquity UPLC HSS T3 色谱柱 (100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)是C18柱，Agilent InfintyLab Poroshell 120 HILICZ 色谱柱 (100 mm × 2.1 mm，2.7 μm) 是两性离子固定相HILIC 柱，Phenomenex Luna HILIC 色谱柱 (100 mm × 2 mm，3 μm) 是非两性离子HILIC柱。6 种化合物在后两种色谱柱中峰形较差，重现性较差，灵敏度较低，而第一种色谱柱可兼容高水相，适用于极性物质的分离，对极性物质具有较好的保留，峰形相对尖锐对称，重现性较好，灵敏度较高，适用于目标待测物的分离分析。因此，本研究选择Waters Acquity UPLC HSS T3 色谱柱用于后续分析研究。

2.1.2 流动相条件优化 由于6 种化合物为强极性物质，故比较了0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸-乙酸铵水溶液和0.1%甲酸-亚甲基二膦酸水溶液3 种流动相对6 种化合物信号响应强度的影响。结果 (图1) 表明：水相中加入乙酸铵后，大部分待测物信号响应强度大大降低，草甘膦、草铵膦等出现色谱峰拖尾。加入一定量亚甲基二膦酸后，与其他两种流动相水相相比，6 种化合物响应强度增强，且峰形较尖锐，这可能是由于草甘膦、草铵膦等具有较强的金属络合能力，能够与仪器管路系统中微量金属络合，导致响应强度降低，峰形异常，而亚甲基二膦酸的双膦酸基团结构具有更强的络合能力，能够竞争性地争夺金属离子，因此能够提高目标物响应强度。综上考虑，本研究选择0.1%甲酸-亚甲基二膦酸水溶液作为流动相水相。

图1 采用不同流动相水相时6 种化合物响应强度 (n=3)Fig.1 Response of six compounds using different water phase of mobile phase (n=3)

2.1.3 亚甲基二膦酸在不同浓度下对目标待测物响应强度的影响 进一步考察流动相中不同浓度(0、2.5、5、10 和15 μmol/L) 亚甲基二膦酸对6 种化合物信号响应强度的影响。结果 (图2) 表明：当亚甲基二膦酸浓度在0～5 μmol/L 时，草甘膦、草铵膦、草铵膦-N-乙酰、3-(甲基膦酸亚基)丙酸及乙烯利响应强度明显增强；当亚甲基二膦酸浓度为5 μmol/L 时，6 种化合物响应强度达到最大，随着亚甲基二膦酸浓度继续升高，目标物信号响应强度降低。表明一定量亚甲基二膦酸能够增强6 种强极性化合物的响应强度，但浓度过高，则会产生离子抑制影响。

图2 不同浓度(0, 2.5, 5, 10, 15 μmol/L)亚甲基二膦酸对6 种化合物信号响应强度的影响 (n=3)Fig.2 Effect of different concentrations of medronic acid(0, 2.5, 5, 10, 15 μmol/L) on peak area of six compounds (n=3)

综合考虑，本研究选用0.1%甲酸-5 μmol/L亚甲基二膦酸水溶液和甲醇为流动相进行洗脱，在此条件下，草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸、3-(甲基磷酸亚基) 丙酸、草铵膦-N-乙酰及乙烯利6 种化合物的保留时间分别为：1.338、1.355、1.306、1.530、2.194 和2.055 min，其提取离子流色谱图如图3 所示。

图3 6 种化合物的提取离子流色谱图(500 μg/L)Fig.3 Extracted ion chromatogram of six compounds(500 μg/L)

2.2 洗针液对进样系统中6 种化合物残留水平的影响

研究发现，当前一次进样含有高浓度样品时，进样系统会有一定量目标物残留，并对下一次进样产生影响。为降低影响，分别考察了纯水、50%甲醇水溶液及0.1%甲酸水溶液作为洗针液对进样系统的影响。结果表明：以0.1%甲酸水溶液作为洗针液时，6 种化合物在进样系统中残留量最少，但仍有少量3-(甲基磷酸亚基) 丙酸残留。因此后续进行了进样系统中6 种化合物残留水平试验，采用0.1%甲酸水溶液作为洗针液，选择高浓度样品 (500 μg/L) 进样一次后，连续5 次进样空白纯水样品，重复3 次。残留水平=纯水空白样品中目标物的峰面积/标准溶液中目标物峰面积 × 100%。由图4 可知，随着空白样品进样次数增多，3-(甲基磷酸亚基)丙酸残留水平逐渐降低，第2 次空白样品进样后，其残留水平小于1%，影响基本可以忽略。因此，在高浓度样品进样后，选择进样一次空白纯水溶液，以降低3-(甲基磷酸亚基)丙酸残留水平，从而提高检测结果的准确性。

图4 进样系统中3-(甲基磷酸亚基)丙酸残留水平 (n=3)Fig.4 Residual level of MPPA in injection system (n=3)

2.3 基质效应评价

基质效应 (Me) 一般是目标物以外的其他杂质成分对目标物的影响，由于目标物成分与其他杂质成分在离子化过程中存在一定的竞争关系，影响目标物的离子化效率，对目标物的响应信号产生增强或抑制作用，可能影响目标物定量准确度、灵敏度等。Me= 基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率，当0.8 ≤Me≤ 1.2 时基质效应不明显，当Me＜ 0.8 时为基质抑制效应，当Me＞ 1.2 时为基质增强效应[24]。本研究分别以过滤后的空白水样和超纯水建立相应的标准曲线，6 种化合物的基质效应在0.95～1.15 之间，基质效应不明显。因此本研究采用外标法定量，以超纯水为溶剂配制系列标准工作溶液。

2.4 线性范围

量取1～500 μg/L 的混合标准工作溶液，按照优化后的色谱及质谱条件，从低浓度到高浓度分别进样。结果表明：草甘膦在5～500 μg/L 线性范围内线性关系良好，草铵膦和草铵膦-N-乙酰在1～500 μg/L 线性范围内线性关系良好，氨甲基膦酸、3-(甲基磷酸亚基)丙酸及乙烯利在10～500 μg/L线性范围内线性关系良好。6 种化合物的决定系数均大于0.99。

2.5 方法的准确度、精密度、检出限及定量限

在空白水样中分别添加10、50、200 μg/L 的混合标准工作溶液，按照1.4 节的条件测定。一天内平行测定6 次，求得日内相对标准偏差 (Intraday RSD)；平行测定6 d，计算日间相对标准偏差(Inter-day RSD) 及平均添加回收率。结果 (表2) 显示：在10～200 μg/L 添加水平下，6 种化合物在水样中的平均回收率在75%～100%，日内及日间相对标准偏差分别为3.6%～7.0%和4.3%～7.5%。

表2 6 种化合物在空白水样中的添加回收率、相对标准偏差、LOD 及LOQ (n=6)Table 2 Recoveries, RSD, LOD, and LOQ for six compounds in blank water samples (n=6)

本研究采用低浓度水平添加方式，并结合信噪比) 确定方法检出限及定量限，以3 倍信噪比得到方法的检出限 (LOD)，10 倍信噪比得到方法的定量限 (LOQ)，则LOD 在0.1～3.0 μg/L 之间，LOQ 在0.5～10 μg/L 之间，低于HJ 1071—2019[25]中草甘膦检出限 (8 μg/L)。本研究方法满足NY/T 3151—2017[26]的要求，可应用于环境水样中乙烯利、草甘膦、草铵膦及其代谢物等6 种强极性化合物的检测。

2.6 实际样品测定

共采集地表水10 份，其中采自福州市2 份、莆田市3 份、龙岩市5 份，按照本研究建立的方法进行检测。结果显示，乙烯利、草甘膦、草铵膦及其代谢物等6 种化合物均未检出。

3 结论

本研究建立了环境水样中乙烯利、草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸、3-(甲基磷酸亚基)丙酸及草铵膦-N-乙酰等6 种化合物的非衍生化超高效液相色谱-串联质谱快速检测方法。该方法利用常规反相色谱柱分离，与衍生化方法相比，具有前处理简便、灵敏度高、稳定性好、重现性好等优点，可应用于环境水中乙烯利、草甘膦、草铵膦及其代谢物等6 种化合物的检测，为环境水中强极性化合物的非衍生化检测提供了一种新方法。