辛夷配方颗粒UPLC指纹图谱及含量测定研究

李振雨，吕渭升，何民友，段志文，杨洁，刘晓霞，魏梅，2，孙冬梅，2，陈向东

1.广东一方制药有限公司，广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244；2.江西一方天江药业有限公司，江西 南昌 330006

辛夷为木兰科植物望春花Magno1ia biondiiPamp.、玉兰Magno1ia denudataDesr.或武当玉兰Magno1ia sprengeriPamp.的干燥花蕾，具有散风寒、通鼻窍作用，用于治疗风寒头痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊[1]。辛夷始载于《神农本草经》，列为上品，历代本草均有收载。现代化学和药理学研究表明，辛夷主要含有挥发油、木脂素、黄酮、生物碱等有效成分，具有抗炎、抗过敏、降压、兴奋子宫等药理作用，临床多用于治疗鼻炎和鼻窦炎等[2-4]。

传统中药饮片临床使用以汤剂为主，汤剂的活性成分是中药临床有效性的物质基础，辛夷配方颗粒以水为溶剂，经现代工业提取、浓缩、干燥、制粒而制成，作为新的饮片形式代替传统饮片供临床辨证论治、随证加减、配方使用[5]。目前辛夷配方颗粒的质量控制模式仍延续传统的化学药品质量控制思路，仅以木兰脂素为定量指标[6-8]，然而以木兰脂素为代表的木脂素类有效成分极性较小、水溶性差，因此，该类化学成分从饮片到配方颗粒的转移率并不高，仅测定木兰脂素等木脂素类成分对辛夷配方颗粒生产工艺的质量控制略显不足；另外，单一化学成分定量分析难以全面反映配方颗粒的内在质量，且缺乏专属性。中药色谱指纹图谱能够提供更为全面、丰富的定性和半定量信息。HPLC指纹图谱因柱效低、色谱分离能力有限、分析时间长等缺点，难以适应中药复杂体系的研究。超高效液相色谱法（UPLC）分辨率高、分离能力强、分析时间大大缩短，在中药指纹图谱建立方面优势明显[9-10]。

本研究采用UPLC建立辛夷配方颗粒指纹图谱，对辛夷配方颗粒有效成分进行定性和半定量分析，并增加对辛夷配方颗粒水溶性成分的定量分析，从多角度控制辛夷配方颗粒的质量，为提升辛夷配方颗粒的质量控制水平提供依据。

1 仪器与试药

Waters H-Class超高效液相色谱仪（沃特世公司），YMC Triart C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9μm），ME204E万分之一分析天平（梅特勒-托利多公司），XP26百万分之一分析天平（梅特勒-托利多公司），JJ600电子天平（常熟市双杰测试仪器厂），KQ500D数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），HWS28型恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司），Milli-Q Direct超纯水系统（默克股份有限公司）。

木兰脂素对照品（中国食品药品检定研究院，批号110882-201708，含量96.5%），木兰花碱对照品（四川维克奇生物科技有限公司，批号wkq17063003，含量98.0%），松脂素二甲醚对照品（伊普赛诺，批号1506434，含量100.0%），表木兰脂素B对照品（四川维克奇生物科技有限公司，批号wka02424，纯度≥98%），辛夷对照药材（中国食品药品检定研究院，批号121079-200704）。乙醇、甲醇为分析纯（西陇科学有限公司），磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）、乙腈（默克股份有限公司）为色谱纯，水为超纯水（实验室自制）。

辛夷配方颗粒10批（批号CG01～CG10），来自广东一方制药有限公司。制备方法：取辛夷饮片6 000 g，加水煎煮，收集挥发油适量（以β-环糊精包合，备用），过滤，滤液浓缩成清膏，加入挥发油包合物，再加入辅料适量，喷雾干燥，加入辅料适量，混匀，制粒，制成1 000 g，即得。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱建立

2.1.1 超高效液相色谱条件

采用YMC Triart C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9μm），以乙腈为流动相A、0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～15 min，10%～15%A；15～25 min，

15%～38%A；25～35 min，38%～44%A；35～39 min，44%～100%A；39～40 min，100%A），流速0.3 mL/min，检测波长230 nm，柱温30℃，进样量1μL。

2.1.2 超高效液相色谱-质谱联用条件

流动相为乙腈-0.1%甲酸，其余色谱条件同“2.1.1”项下，电喷雾离子源（H-ESI），正离子扫描模式，扫描范围（m/z）70～1 050 Da，归一化碰撞电压（NCE）20 V，鞘气压力35 arb，辅助压力10 arb，喷雾电压3.80 kV，吹扫气0 arb，0S-lens电压50 V，毛细管温度350℃，加热温度350℃。

2.1.3 对照品溶液制备

取木兰脂素、木兰花碱、松脂素二甲醚和表木兰脂素B对照品各适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL含木兰脂素55μg、木兰花碱100μg、松脂素二甲醚100μg和表木兰脂素B 50μg的溶液，即得。

2.1.4 供试品溶液制备

取辛夷配方颗粒适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.1.5 指纹图谱方法学考察

2.1.5 .1精密度试验

取辛夷配方颗粒（批号CG09）适量，研细，取约0.2 g，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，连续进样6次，以5号峰木兰脂素峰为参照峰S，计算其余共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD。结果显示，各共有峰的相对保留时间RSD为0.04%～0.19%，相对峰面积RSD为0.10%～0.69%，均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 .2重复性试验

取辛夷配方颗粒（批号CG09）适量，研细，取约0.2 g，平行6份，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，以5号峰木兰脂素峰为参照峰S，计算其余共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD。结果显示，各共有峰的相对保留时间RSD为0.06%～0.25%，相对峰面积RSD为0.14%～0.63%，均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.1.5 .3稳定性试验

取辛夷配方颗粒（批号CG09）适量，研细，取约0.2 g，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行分析，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，以5号峰木兰脂素峰为参照峰S，计算其余共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD。结果显示，各共有峰的相对保留时间RSD为0.07%～0.24%，相对峰面积RSD为0.20%～0.51%，均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.6 指纹图谱建立及分析

分别取10批辛夷配方颗粒样品，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行分析，记录各批次辛夷配方颗粒样品指纹图谱。将10批辛夷配方颗粒指纹图谱的CDF格式导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012.130723版）软件，以批号CG09样品指纹图谱为参照图谱，进行共有峰标识，共标定7个共有指纹峰（见图1），进行多点保留时间校正和峰匹配，生成辛夷配方颗粒对照指纹图谱（见图2）。计算10批辛夷配方颗粒样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，结果见表1。

图1 10批辛夷配方颗粒UPLC指纹图谱共有峰标识

图2 辛夷配方颗粒UPLC对照指纹图谱

表1 10批辛夷配方颗粒指纹图谱相似度评价

10批辛夷配方颗粒指纹图谱的相似度为0.965～0.997，表明10批样品具有较高的相似性。为严格控制辛夷配方颗粒的大生产质量，根据10批样品测定结果，规定按《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012.130723版）计算，辛夷配方颗粒供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度应不得低于0.95。

2.1.7 指纹图谱共有指纹峰的高分辨质谱指认

取辛夷配方颗粒（批号CG09）供试品溶液，按“2.1.2”项下色谱和质谱条件进样分析，根据高分辨质谱提供的准确分子量与辛夷配方颗粒样品质谱图中未知色谱峰的分子量进行对比，结合目标色谱峰的二级质谱信息，并与赛默飞mzVault标准数据库进行匹配，对辛夷配方颗粒指纹图谱7个共有指纹峰进行指认，共指认出其中4个成分，分别为2号峰木兰花碱、4号峰松脂素二甲醚、5号峰木兰脂素和7号峰表木兰脂素B，见图3、表2。

表2 辛夷配方颗粒指纹图谱指纹峰鉴定

图3 辛夷配方颗粒UPLC指纹图谱共有指纹峰的质谱指认

2.1.8 指纹图谱共有峰的对照品确证

根据质谱指认结果，通过对照品保留时间比对，并结合紫外-可见3D光谱图，对高分辨质谱指认出的色谱峰进行确证，确定峰2为木兰花碱、峰4为松脂素二甲醚、峰5为木兰脂素、峰7为表木兰脂素B，见图4。

图4 辛夷配方颗粒UPLC指纹图谱共有峰的对照品确证

2.2 木兰脂素和木兰花碱含量测定

2.2.1 色谱条件

同“2.1.1”项下。

2.2.2 对照品溶液制备

取木兰脂素和木兰花碱对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含木兰脂素55μg、木兰花碱100μg的混合溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备

同“2.1.4”项下。

2.2.4 精密度试验

取木兰脂素、木兰花碱对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次，木兰脂素及木兰花碱峰面积的RSD分别为0.68%、2.6%，均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 线性关系考察

精密称取木兰脂素对照品19.462 mg、木兰花碱对照品20.356 mg置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1 mL含木兰脂素1 878.083μg、木兰花碱1 994.888μg的对照品贮备液。分别精密移取上述对照品贮备液5.0、2.0、1.0、0.5、0.1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别精密吸取上述6个不同浓度对照品溶液1μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。木兰脂素回归方程为：Y=1 871.81X+3 442.95，r=0.999 9，表明木兰脂素在18.781～1 878.083μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。木兰花碱回归方程为：Y=11.899X+17.288，r=0.999 9，表明木兰花碱在19.949～1 994.888μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.2.6 重复性试验

取辛夷配方颗粒样品（批号CG09）适量，研细，取约0.2 g，精密称定，平行6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，计算木兰脂素和木兰花碱的平均含量和RSD。结果显示，木兰脂素平均含量为22.87 mg/g，RSD=0.27%；木兰花碱平均含量为24.62 mg/g，RSD=1.49%。RSD均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 加样回收率试验

分别精密称定木兰脂素对照品24.576 mg、木兰花碱对照品27.719 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品加样母液。取9个锥形瓶，分为3组，每组3个，按样品与对照品含量为1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例分别加入木兰脂素和木兰花碱对照品母液各1、2、3 mL，氮气吹干。取辛夷配方颗粒（批号CG09），研细，取约0.1 g，平行9份，精密称定，置于上述锥形瓶中，按“2.2.3”项下确定的方法制备9份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算木兰脂素和木兰花碱的含量和加样回收率。结果木兰脂素加样回收率为95.16%～98.32%，平均回收率为96.51%，RSD=0.86%；木兰花碱加样回收率为94.60%～103.19%，平均回收率为99.10%，RSD=2.80%，均符合要求，表明该方法准确度良好。结果见表3。

表3 木兰脂素、木兰花碱加样回收率试验结果

2.2.8 稳定性试验

取辛夷配方颗粒（批号CG09）适量，研细，取约0.2 g，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样测定，记录峰面积，计算木兰脂素、木兰花碱峰面积RSD分别为0.36%、0.24%，均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.9 样品测定

按“2.2.3”项下方法制备10批辛夷配方颗粒供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，采用外标法计算辛夷配方颗粒中木兰脂素和木兰花碱的含量，结果见表4。

表4 10批辛夷配方颗粒中木兰脂素和木兰花碱含量测定结果（mg/g）

10批辛夷配方颗粒样品木兰脂素含量为18.65～27.87 mg/g，木兰花碱含量为21.20～32.97 mg/g，不同批次辛夷配方颗粒木兰脂素和木兰花碱的含量存在一定差异。根据10批辛夷配方颗粒木兰花碱的含量测定结果，以均值的70%为限度标准，辛夷配方颗粒木兰脂素的含量应不低于16.96 mg/g，修约为17.0 mg/g，即每1 g配方颗粒含木兰脂素（C23H28O7）应不低于17.0 mg；辛夷配方颗粒木兰花碱的含量应不低于18.86 mg/g，修约为19.0 mg/g，即每1 g配方颗粒含木兰花碱（C20H24NO4）应不低于19.0 mg。

3 讨论

本试验采用UPLC对辛夷配方颗粒指纹图谱与有效成分的含量进行同时测定，在45 min内即完成主要色谱峰的良好分离，且230 nm处色谱峰数目较多、响应值较大、基线平稳，定量指标木兰脂素和木兰花碱的分离度和峰纯度符合定量要求，因此选择230 nm作为检测波长。流动相的筛选考察了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液和甲醇-水3种溶剂系统的洗脱和分离效果，结果显示，以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，各色谱峰出峰时间短、分离度较好。考察4种不同品牌和填料的色谱柱YMC Triart C18（2.1 mm×100 mm，1.9μm）、Agilent SB C18（2.1 mm×100 mm，1.8μm）、Waters HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8μm）、Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7μm）对各色谱峰的分离效果，结果采用YMC Triart C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9μm）时各色谱峰分离效果最佳。含量测定与指纹图谱方法一致，在保证主要色谱峰得到较好的分离情况下，缩短分析时间。

本研究对供试品溶液的制备方法进行考察，包括提取溶剂、提取方式、提取时间以及提取溶剂用量，最终确定样品的最佳前处理方法。在提取溶剂考察中，分别考察了甲醇、80%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、10%甲醇、乙醇、70%乙醇、稀乙醇和水等溶剂，结果显示，采用80%甲醇为提取溶剂，辛夷配方颗粒指纹图谱各共有指纹峰的总峰面积/称样量值及2种有效成分的含量最大，因此，选择80%甲醇为提取溶剂。同时比较了超声与回流提取方式，结果显示，2种提取方式各共有指纹峰的总峰面积/称样量值、峰型及分离效果，以及木兰脂素和木兰花碱的含量无明显差异，为操作方便，选择超声提取的处理方式。此外，对不同超声时间（15、30、45 min）及提取溶剂不同用量（15、25、50 mL）进行考察，以各共有指纹峰的总峰面积/称样量值及2种有效成分的含量为考察指标，优选最佳的提取时间和溶剂用量，结果显示，采用80%甲醇25 mL超声提取30 min的提取效率最高。

鉴于中药有效成分的多样性及复杂性，单一成分定量的化学药品质量控制模式既缺乏专属性，又难以反映中药内在质量属性，因此，采用指纹图谱结果多成分含量测定的方式，实现对辛夷配方颗粒的质量控制，结果显示，10批辛夷配方颗粒指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均在0.95以上，表明不同批次的配方颗粒样品相似度较高，生产工艺相对比较稳定。

2020年版《中华人民共和国药典》辛夷项下仅以木兰脂素为含量测定指标，难以反映辛夷配方颗粒的内在质量。本研究采用UPLC建立辛夷配方颗粒的指纹图谱，同时测定其木兰脂素、木兰花碱含量，以建立的方法对10批辛夷配方颗粒的指纹图谱相似度及木兰脂素、木兰花碱含量进行了比较，实现对辛夷配方颗粒中有效成分的定性和半定量分析，并增加对辛夷配方颗粒中水溶性成分的定量分析，从多角度控制辛夷配方颗粒的质量，该方法专属性强，分析时间短，能够有效提升辛夷配方颗粒的质量控制水平。