基于代谢组学探讨艾灸关元穴对老年大鼠肾能量代谢的影响＊

王 慧，陈丽梅，徐瑞祥，陈 钊，周娟清，卓文浩，刘红宁＊＊

（1.江西中医药大学 南昌 330004；2.江西中医药大学附属医院 南昌 330006；3.启东市人民医院 南通 226200）

《素问·上古天真论》中以女子七、男子八为基数递进描述了生长、发育、衰老曲线与肾气盛衰相关联。人之生长壮老，皆由阳气为之主[1]，阳化气的过程相当于物质代谢产生能量的过程[2]。且对人体生命而言，阳是人体温热的能量[3]。随着年龄的增大，制造能量的线粒体会积累活性氧诱导的损伤，导致线粒体功能下降[4-5]。动物实验显示，24月龄大鼠离体心肌线粒体膜脂类物质多不饱和脂肪酸含量随年龄的增加而明显下降[6]。大鼠睾丸线粒体膜多不饱和脂肪酸的含量随年龄的增加而明显下降，且饱和脂肪酸的比例增加，因此多不饱和脂肪酸的百分含量下降[7]。有研究显示老年小鼠脑线粒体耗氧速率明显低于青年小鼠[8]，可能是呼吸链的活性较低所致，而琥珀酸脱氢酶（SDH）是线粒体的关键酶，参与细胞能量所需ATP的生物合成，有研究显示衰老对小鼠心室肌细胞SDH水平有明显的抑制作用[9]，影响线粒体的正常功能，因此线粒体是生命能量的创造者，线粒体的功能对衰老细胞的影响至关重要。

《扁鹊心书》提出“人于无病时，常灸关元……，虽未得长生，亦可保百余年寿矣。”这种以灸法预防衰老的方法称为“保健灸”[10]。艾灸燃烧时可通过热效应、光辐射和药效应等将热量传入人体，为机体细胞代谢活动提供必要的能量，也能为能量缺乏的病态细胞提供活化能[11]。关元穴为元气所存之处，赵小恒[12]认为独灸关元进行养生，可以起到补益元气、温肾健脾、温中散寒、补肾纳气、温暖下元、延年保健的作用。研究表明艾灸关元穴可以改善阿尔茨海默病（AD）小鼠的三羧酸代谢和不饱和脂肪酸代谢来改善AD动物的学习记忆功能[13]。金匮肾气丸有温补肾阳、行气化水之效，且是温补肾阳、延缓衰老的代表方[14]，本文以此药作为该研究的观察对比用药。

代谢组学主要用于分析生物生理与病理状态下内源性小分子代谢物的差异，通过数据分析，可以检测出生物体代谢产物的微小变化，与中医药的整体性、动态性原则相吻合[15]。艾灸作为一种治疗方式灵活、费用低廉的预防保健手段，其作用机制值得进一步研究。

基于此，本实验选取自然老龄化大鼠为研究对象，通过观察肾脏病理状态、肾功能水平、线粒体呼吸耗氧速率和琥珀酸脱氢酶的活性，利用代谢组学技术研究艾灸关元穴对老年大鼠肾代谢的影响，初步探讨艾灸关元穴对老年大鼠补肾阳的作用机制。

1 实验方法

1.1 主要仪器与试剂

安捷伦超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱仪（美国Aglient，1290-G6538）；真空离心浓缩仪（美国Thermo Fisher，SPD131DDA-P1-230）；高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher，LYNX6000）；多功能酶标仪（瑞士Tecan，Spark 10M）；高通量冷冻组织研磨仪（美国SPEX，Geno2010）；紫外可见分光光度计（日本岛津，UV-2600）；全自动生化分析仪（美国Beckmancoulter，AU480）；石 蜡 包 埋 机（徕 卡，EG1150）；石蜡切片机（徕卡，RM2016）；显微镜（明美，MF43）；金匮肾气丸（北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，产品批号：20030989）；5%金匮肾气丸含药饲料（上海帆泊生物技术有限公司，批号：20200831）；艾条（江西鄱艾生物科技有限公司，艾绒比∶8∶1，直径8 mm）；HPLC级甲醇、乙腈（德国Merck）；甲酸（Dikma Pure，批号：2486917）。SM0020线粒体提取试剂盒（Solarbio，批号：20201027）；ab197243细胞外氧气消耗量试剂盒（Abcam，批号：GR3351604-2）；琥珀酸（Solarbio，批号：225E081）；蔗糖（西陇科学，批号：191202）；氯化钾（KCl）（西陇科学，批号：200301）；乙二醇双2-氨基乙醚四乙酸（EGTA）（MACKUN，批号：C10916981）；氯 化 镁（MgCl2）（西 陇 科 学，批 号：20180730）；磷酸氢二钾（K2HPO4）（西陇科学，批号：180608）；琥珀酸脱氢酶（SDH）测试盒（南京建成，批号：20201221）；总蛋白定量（考马斯亮蓝法）（南京建成，批号：20201209）；肌酐（Cr）、尿酸（UA）、尿素（UREA）血清试剂盒均购自湖南海源医疗科技股份有限公司（批号：20210129、20201110、20200925）。

1.2 实验动物和样品收集

8月龄、21月龄雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（许可证号：SCXK（湘）2019-0004）。大鼠适应性喂养1周，喂养过程中由于老年大鼠自然衰老死亡1只，故将8月龄SD雄性大鼠作为成年对照组（n=8），21月龄雄性大鼠随机分为老年对照组（n=8）、老年金匮肾气丸组（n=7）、老年艾灸组（n=8）。老年艾灸组大鼠参照《大鼠标准穴位图谱》取穴，将穴区1.0 cm左右的鼠毛剃干净，艾灸时大鼠用黑色袜子套头，保持老鼠躺平的姿势，艾条在穴区上方2 cm左右燃烧，保持温热感，使老鼠舒适安静。每日艾灸关元穴（CV4）15 min，5日1疗程，实验持续13周，其余组大鼠均按相同的方法和时间抓取。老年金匮肾气丸组每日分框按大鼠体重喂食5%含药饲料，给药剂量由成人临床用量10 g/60 kg的6.3倍换算而来，同样5日1疗程，实验持续13周。

实验结束后，禁食不禁水12 h，解剖后腹主动脉取血，将血液在室温下静置2-3 h，4℃条件下3500 rpm离心15 min，放入-80℃冰箱，备用。取血后摘取新鲜肾组织，PBS缓冲液洗净残留血液，滤纸吸干，立即切取100 mg用于提取线粒体。另取一部分肾组织经4%多聚甲醛溶液固定24 h，制作成HE染色病理切片，剩下的组织放于-80℃保存，供试剂盒检测和代谢组学研究。

1.3 大鼠血清肾功能的测定

采用全自动生化分析仪检测大鼠血清肌酐（Cr）、尿酸（UA）、尿素（UREA）含量。

1.4 观察肾组织形态变化

将肾组织从多聚甲醛中取出，石蜡包埋、切片、HE染色，采用光学显微镜进行病理组织学观察。

1.5 线粒体外耗氧速率实验

1.5.1提取线粒体

取新鲜肾组织100 mg，放入预冷的Dounce匀浆器内，添加1 mL预冷的Lysis Buffer进行匀浆。取出上清，按说明书操作进行梯度离心，最后弃上清，得高纯度线粒体沉淀。

1.5.2线粒体代谢速率测定

缓 冲 液 的 配 制：250 mmol·L-1蔗 糖，15 mmol·L-1KCl，1 mmol·L-1EGTA，5 mmol·L-1MgCl2，30 mmol·L-1K2HPO4，PH=7.4，过滤除菌。

向细胞外氧气消耗试剂中添加1 mL双蒸水，并充分混匀，测时用缓冲液稀释制成重组探针。向明底黑色壁的96孔板中加入重组探针100µL、线粒体50µL和100 mmol/L琥珀酸底物50µL。空白对照孔中只加入缓冲液200µL。立即用37℃高灵敏度矿物油（2滴）密封每个孔，并除去气泡。将96孔板插入预热至37℃的酶标仪，Ex/Em=380/650 nm条件下持续检测信号10-30 min。

1.6 琥珀酸脱氢酶（SDH）活性

取储存于-80℃冰箱的肾组织，用生理盐水按重量体积比1∶9制备成组织匀浆液，在4℃条件下3500 rpm离心10 min，取上清，按试剂盒说明书操作。组织蛋白的测定采用考马斯亮蓝法。

1.7 代谢组学检测

1.7.1肾组织样品前处理

将样本从-80℃冰箱中取出，称取肾组织200 mg，加入1.5 mL预冷的水：甲醇（20∶80）进行低温匀浆，涡旋振荡3-5 min。然后，在4℃条件下以15000 rpm离心15 min，吸取上清液，低温浓缩使其干燥。将残渣用甲醇复溶，混匀，在4℃条件下以15000 rpm离心15 min。最后从每个样品上清液中取10µL混合作为QC（quality control）样品以监控整个实验，经0.22 µm有机滤膜滤过后上机检测。

1.7.2色谱条件

安捷伦超高液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱（UHPLC-Q-TOF-MS）；色谱柱为ZORBAX Extend-C18（2.1×100 mm，3.5 µm，Agilent），流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为乙腈；梯度洗脱条件：0-8 min，2-28% B；8-10 min，28-54% B；10-15 min，54-71% B；15-18min，71-88% B；18-19 min，88-100% B；19-20 min，100-2%B；20-21 min，2%B。进样量6µL，柱温35℃，样品室温度4℃，流速0.4 mL·min-1。

1.7.3质谱条件

采用双电喷雾离子源（Dual ESI），正离子模式下，干燥器温度：350℃，流速10 L·min-1，扫描方式：Full Scan，扫描范围：m/z 50-1000，毛细管电压：4000 V，喷雾室压力：35 psig，碎片电压：175 V，锥孔电压：65 V。负离子模式下，毛细管电压：3500 V，其余条件同正离子模式。

1.8 统计方法

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA），符合正态分布且方差齐以LSD检验法进行组间比较。P＜0.05表示差异具有统计学意义。实验结果均采用平均值±标准差（xˉ±s）表示。

2 结果

2.1 肾组织形态结构

光学显微镜结果显示成年对照组大鼠肾小球结构正常，均匀分布于肾皮质中（图A1，A2）；老年对照组肾小球体积略微增大，偶见间质淤血，肾小管管腔中偶见嗜酸性蛋白液，形成管型（图B1，B2）；老年金匮肾气丸组肾小球体积略微增大，肾小管管腔中偶见嗜酸性蛋白液，形成管型（图C1，C2）；老年艾灸组肾小球体积略微增大，偶见间质淤血，但程度较老年对照组减轻（图D1，D2）。

2.2 艾灸关元穴对血清肾功能的影响

结果显示，与成年对照组大鼠比较，老年对照组大鼠肾功能水平无显著性差异（P＞0.05），与老年对照组大鼠比较，老年金匮肾气丸组大鼠肾功能水平无显著性差异，老年艾灸组大鼠血清Cre含量显著降低。结果见表1。

表1 大鼠血清肾功能水平的比较（±s）

表1 大鼠血清肾功能水平的比较（±s）

注：与老年对照组比较，#P＜0.05。

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2.3 艾灸关元穴对肾线粒体耗氧速率的影响

对OD值下降曲线进行线性回归，得到线性回归方程，方程斜率的绝对值越大说明线粒体代谢速率越快。与老年对照组比较，成年对照组大鼠肾线粒体耗氧速率显著高于老年对照组（P＜0.01），老年金匮肾气丸组和老年艾灸组均能显著升高老年大鼠肾线粒体耗氧速率（P＜0.01）。结果见图2。

图2 各组大鼠肾组织线粒体耗氧速率比较

2.4 艾灸关元穴对肾组织SDH酶活力的影响

实验结果显示，随着年龄的增长，老年大鼠较成年大鼠的肾组织SDH酶活力显著降低（P＜0.01）；与老年对照组比较，老年金匮肾气丸组和老年艾灸组大鼠的肾组织SDH酶活力均显著升高（P＜0.01），结果见图3。

注：与老年对照组比较，##P＜0.01。

图1 各组大鼠肾组织形态结构

2.5 艾灸关元穴对肾组织代谢模式的影响

2.5.1肾组织代谢物谱的UHPLC-Q-TOF-MS分析

正、负离子模式下成年对照组、老年对照组、老年金匮肾气丸组、老年艾灸组大鼠肾组织总离子流图谱见图4。从图中可以看出，样本重叠性较好，说明仪器运行稳定。正离子模式下老年对照组相较于成年对照组肾组织总离子流图发生了明显的变化，说明随着年龄的增长，老年大鼠肾组织代谢产物发生了变化，且艾灸关元穴和金匮肾气丸给药使老年大鼠肾组织代谢产物接近成年对照组大鼠。

图4 正负离子模式下各组大鼠肾组织总离子流图

2.5.2多元统计分析

将数据导入SIMCA 14.1软件并采用有监督模式的偏最小二乘法判别分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）方法对各组肾组织样本进行代谢轮廓分析。分析结果显示，正离子模式下老年金匮肾气丸组和老年艾灸组没有完全分离开（图5A），负离子模式下老年对照组和老年金匮肾气丸组没有完全分离开（图5B）。但是通过三维图可知，正离子模式下老年金匮肾气丸组和老年艾灸组只有个别样本分离不开，说明两者代谢谱是接近的（图5C），负离子模式下老年对照组和老年金匮肾气丸组能够很好的分开（图5D）。正负离子模式下金匮肾气丸和艾灸关元穴对老年大鼠肾代谢物都产生了明显影响。为了验证模型可靠性，对PLS-DA模型数据进行200次随机排列实验，结果表明，模型验证结果显示左侧所有R2和Q2值低于右侧原始点，Q2截距值等于或小于0，表明模型未产生过分拟合，此模型可靠[16][截距：R2=0.702，Q2=-0.109（图5E）；R2=0.34，Q2=-0.37（图5F）]。

图5 正负离子模式下大鼠肾组织代谢物PLS-DA得分图和置换检验

2.5.3潜在生物标记物的分析

通过MPP软件分析，筛选出Fold-change＞2及P＜0.05的代谢物作为潜在生物标志物，通过HMDB数据库结合二级质谱信息对筛选出的大鼠潜在生物标记物进行鉴定指认。以保留时间RT 16.28，m/z 280.2633的离子为例，通过分子特征提取，得到[M+H]+（m/z 280.2635），分子式C18H33NO在MassHunter中得分值比较高，在MS/MS图谱中主要有m/z 55.0538、m/z 83.0858、m/z 95.0870、m/z 124.1195、m/z 175.1490、m/z 245.2212、m/z 265.0197、m/z 280.2635的碎片离子，通过与HMDB数据库进行匹配，发现与亚油酰胺化合物的图谱最吻合，对应数据库m/z 55.0542、m/z 83.0855、m/z 245.2264、m/z 280.2635。因此该化合物被鉴定为亚油酰胺，见图6。利用此方法在正离子模式中鉴定出4个共同潜在生物标记物，分别是丁酸十二烷基酯、亚油酰胺、5-甲基四氢叶酸、PC(16：0/22：5(7Z，10Z，13Z，16Z，19Z))，在负离子模式中鉴定出9个共同潜在生物标记物，分别是6,8-二羟基嘌呤、1,2,3-丙烷三羧酸、3-(4-甲氧基苯基)-2-氧代丙酸、吲哚-3-乙酰甘氨酸、亚麻油酸、9,10-环氧十八烷酸、二十二碳五烯酸(22n-6)、牛磺胆酸、LysoPS(18:0/0:0)。结果见表2。

表2 肾组织中鉴定的潜在生物标记物及变化趋势

图6 亚油酰胺二级质谱图

2.5.4代谢通路

将鉴定所得潜在生物标记物数据带入在线数据库MetaboAnalyst 5.0进行通路富集分析，结果显示潜在生物标记物主要参与亚油酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、叶酸参与的一碳单位代谢、α-亚麻酸代谢、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢、初级胆汁酸生物合成，见图7。

图7 大鼠肾组织代谢通路图

3 讨论

阴阳五行学说中把对于人体具有推进、温煦、兴奋等作用的物质和功能统归于阳[17]，中医认为，肾阳为各脏阳气之本，对各脏腑、组织器官起着推动、温煦的作用，肾阳得以温煦，则人体机能活动旺盛。线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位，是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所，其负责的最终氧化的共同途径是三羧酸循环与氧化磷酸化[18]。琥珀酸脱氢酶是线粒体内膜的结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一[19]。作为参与三羧酸循环的关键酶，琥珀酸脱氢酶是反映线粒体功能的标志酶之一。本研究结果显示，青年大鼠肾组织线粒体呼吸耗氧速率和琥珀酸脱氢酶的活力明显高于老年大鼠，由此可见，青年大鼠处于生长发育阶段，其肾气旺盛，而其代谢也处于旺盛阶段。随着年龄的增长，机体肾功能下降，且与线粒体功能有关[20]。阳气是人体热量的来源，金匮肾气丸给药和艾灸关元穴后都能够提高老年大鼠的肾组织线粒体功能，推测艾灸可能通过影响线粒体三羧酸循环中的中介物质来提高肾组织的能量代谢，从而进一步推动肾阳的温煦作用。

能量代谢系统是需氧生物体内分布于线粒体的普遍代谢途径，是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。牛磺胆酸为一种常见的结合型胆汁酸，牛磺胆酸由胆酸的羧基与牛磺酸的氨基以酰胺键结合而成，参与脂类的消化吸收[21]，在人类机体中，胆汁酸合成的减少与年龄增长有关。牛磺酸是参与多个氨基酸代谢与能量代谢的关键蛋白转化节点，牛磺酸和亚牛磺酸代谢路径侧面反应了机体的能量代谢水平[22]。有研究提到牛磺酸含量下降60%与严重的呼吸链功能障碍有关[23]，细胞牛磺酸耗竭会降低呼吸功能并增加线粒体超氧化物的生成[24]，可能会使呼吸链复合物I（NADH氧化酶）和III（细胞色素c氧化还原酶）的活性下降，耗氧量减少[25]。有研究[26]表明长期补充低剂量的牛磺酸可以减轻与SD大鼠年龄相关的O2消耗下降，并且能够提高比目鱼肌和胃肌中SDH基因的表达，提高肌肉SDH活性，说明牛磺酸与能量代谢密切相关。本实验的代谢组学结果显示，牛磺胆酸在老年金匮肾气丸组和老年艾灸组的肾组织中含量下降且与成年对照组趋势一致，牛磺酸的含量可能升高，侧面反应出艾灸关元穴能够调节老龄化机体的能量代谢水平。

亚麻酸和亚油酸是人体中重要的必须脂肪酸，α-亚麻酸（α-linolenic acid，ALA）是n-3多不饱和脂肪酸（EPA、DHA）合成前体，二十二碳五烯酸（Docosapentaenoic acid，DPA）是ALA在体内生成二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的中间产物。n-3多不饱和脂肪酸被报道可以改善线粒体功能，增加心肌细胞中的线粒体质量[27]，减缓小鼠线粒体蛋白质质量随年龄的下降[28]。补充人体必备脂肪酸被证明可上调线粒体解偶联蛋白（UCP）的表达，保持氧化还原状态，从而在能量代谢中起着关键作用[29-30]。亚油酸已被证明可以防止心磷脂含量降低并改善患有自发性高血压心力衰竭（HF）的老年大鼠的线粒体功能[31]。细胞膜和线粒体膜的主要磷脂组分是甘油磷脂，磷脂（PL）的脂肪酸（FA）组成对线粒体膜功能有很大影响[32]，有研究表明线粒体膜的脂质组成与线粒体在能量代谢和氧气消耗中的作用有关[33]。本研究中结果显示，金匮肾气丸和艾灸关元穴可使老年大鼠肾组织中亚麻油酸、二十二碳五烯酸和亚油酰胺含量升高，推测艾灸和金匮肾气丸可能都通过促进亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、甘油磷脂代谢来提高老年大鼠肾组织能量代谢。

综上，本实验通过对老年大鼠血清肾功能、肾组织形态结构、线粒体耗氧速率和琥珀酸脱氢酶活力的检测，并从代谢组学分子层面观察艾灸关元穴对老年大鼠肾组织能量代谢的影响。其中，老年艾灸组和老年金匮肾气丸组与老年对照大鼠相比，肾结构状态和肾功能指标均无显著性影响，说明长期艾灸补阳与从内服用药物补阳对老年大鼠的肾功能均无明显损害作用。不少学者认为，肾阳虚和机体能量代谢是密切相关的[34-36]。艾灸关元穴能够提高老年大鼠肾组织线粒体能量代谢的功能，侧面反应出艾灸关元穴可通过温补肾阳的作用促进肾的能量代谢，这种作用可能是通过牛磺酸和亚牛磺酸代谢、α-亚麻酸代谢、亚油酸代谢、甘油磷脂代谢来调控的。艾灸具有治疗方便、经济、安全，易被患者接受等特点，是一种有潜力的保健方法，值得进一步发掘以发挥中医药在治未病中的主导作用。