英夫利西单抗对脑出血模型小鼠的改善作用及机制研究

罗瑞琦 严美茹 王思媛 张燕平

出血性脑卒中占所有脑血管病的20%～30%，具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点。目前尚缺乏有效的干预方法。研究发现，炎症是继发性脑损伤的基本要素。在脑出血发生后，活化的小胶质细胞释放促炎细胞因子和趋化因子，引起血肿周围炎症细胞的大量聚集，从而造成脑实质的继发性损伤[1]。因此，抑制炎症反应的发生可能是减弱脑出血后继发性损伤的有效途径。

英夫利昔单抗作为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的单克隆抗体，具有明确的抗炎作用，对克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病均有一定的疗效。近年来，有研究发现英夫利昔单抗在缺血性脑卒中中能够通过调控小胶质细胞的转化、改善血脑屏障、减轻炎症反应从而发挥改善神经功能的作用，但其在出血性脑卒中中是否能够减轻炎症损伤尚无明确研究。故本研究拟通过胶原酶法构建小鼠脑出血模型，通过尾静脉注射英夫利昔单抗，探究英夫利西单抗对脑出血小鼠脑部炎症反应及预后的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：10月龄SPF级雄性C57BL/6小鼠144只，体重为24～26 g，购自郑州市华兴实验动物公司，动物合格证号为SCXK(豫)2019-0002。

1.1.2主要试剂和仪器：英夫利西单抗(HY-P9970，上海皓元生物医药科技有限公司)；Ⅶ型胶原酶(美国Sigma-Aldrich公司)；星形胶质细胞表面标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)兔一抗(货号GB11096)、小胶质细胞表面标志物钙离子接头蛋白(IBA-1)(货号GB113502)、中性粒细胞表面标志物髓过氧化物酶(MPO)兔一抗(货号GB11224)，相应CY3标记的山羊抗兔荧光二抗(货号GB21303)，以及ACTIN抗体(货号GB12001)、白细胞介素6(IL-6)抗体(货号GB11117)、TNF-α抗体(货号GB11188)、DAPI(货号G1012)均购自武汉servicebio公司；白细胞介素1β(IL-1β)抗体(货号AF5103，美国AFFinity公司)；轻便小鼠脑立体定位仪(瑞沃单臂数显定位仪；深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；Ni-U正置荧光显微镜(日本尼康公司)；微量进样针(SYR 1 μL；瑞士汉斯尔顿公司)；CM1860冰冻切片机(德国徕卡公司)；Advenyurer AV 264 AV万分之一天平、Starter 2C PH计购自美国奥豪斯公司；苏静SW-CJ-1FD超净工作台(江苏苏静公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠分组和处理：144只小鼠随机分为假手术组、假手术+英夫利西单抗组、脑出血组及脑出血+英夫利西单抗组四组，每组36只。脑出血组及脑出血+英夫利西单抗组均在左侧尾状核处颅骨打孔，微量注射器进针并泵入0.5 μL Ⅶ型胶原酶(0.075 U)，制作脑出血模型，以术后第1天NDS评分≥4分视为造模成功；假手术组及假手术+英夫利西单抗组上述同样方法进针，但不泵入胶原酶。假手术+英夫利西单抗组及脑出血+英夫利西单抗组术后按体重10 mg/kg予英夫利西单抗尾静脉给药，之后每天相同时间给药，连续用药3 d。

1.2.2小鼠肛温及体重检测：小鼠的肛温即小鼠的中心温度，于术后第1天、3天、7天、14天及28天每日清晨8点在小鼠安静状态下测量并记录假手术组、假手术+英夫利西单抗组、脑出血组及脑出血+英夫利西单抗组小鼠的肛温及体重。

1.2.3Western blot法检测血肿周围TNF-α、IL-1β、IL-6的相对表达水平：于造模成功后第1天，随机选取假手术组、假手术+英夫利西单抗组、脑出血组及脑出血+英夫利西单抗组小鼠每组各6只，以含3%(体积分数)异氟烷的氧气通过鼻导管吸入，小鼠深度麻醉后迅速颈椎脱臼处死取脑组织，取血肿灶周围5 mm以内脑组织为样本，假手术组取同部位脑组织，按照脑组织(mg)∶蛋白酶裂解液(μL)=1∶10的比例加入蛋白酶裂解液，使用研磨棒研磨脑组织，裂解后匀浆离心收集所得上清液，酶标仪测定各样品的分光光度值，计算样品蛋白浓度，将配置好的SDS-PAGE凝胶夹入电泳仪中，按顺序加样蛋白样品并电泳，PVDF膜和滤纸、凝胶精确对齐后放入转膜槽，转膜槽设置为300 mA即可转膜，PVDF膜经脱脂牛奶封闭后，在1×TBST(100 mL 10×TBS+1 mL Tween-20，加超纯水定容至 1000 mL)摇床中洗涤15 min，用含5%(质量浓度)BSA的1×TBST按1∶1000稀释IL-6抗体、IL-1β抗体、TNF-α抗体及ACTIN抗体(内参)，于4℃孵育过夜，裁剪PVDF膜至合适大小后放在含有一抗稀释抗体的抗体孵育盒中，用1×TBST洗涤15 min后加入稀释后的二抗(1∶5000)，将ECL底物充分混匀后，均匀涂于PVDF膜上，使用Bio-RAD拍照后采用Image J软件定量分析各组蛋白与内参的灰度值，目的蛋白的相对水平=目的蛋白的灰度值/相应内参的灰度值。

1.2.4干湿重法测定脑含水量(BWC)：于造模术后第3天，随机抽取假手术组、假手术+英夫利西单抗组、脑出血组及脑出血+英夫利西单抗组小鼠各8只，使用3%异氟烷通过鼻导管吸入麻醉，小鼠进入深度麻醉后立刻颈椎脱臼处死取脑，沿纵裂及中脑水平切断获取左大脑半球、右大脑半球及小脑，并立即用微量天平分别进行称重，此为湿重(wet wight，WW)，将称量过的鼠脑放入烤箱中，60℃烘烤12 h后再用100℃烘烤12 h，取出再次称重，此为干重(dry weight，DW)，然后根据Eliot公式计算BWC：BWC=(WW-DW)/WW×100%。

1.2.5免疫荧光染色测小胶质细胞、星形胶质细胞和中性粒细胞的浸润情况：脑出血组及脑出血加用英夫利西单抗组小鼠于造模后第3天，随机选取6只，使用3%异氟烷通过鼻导管吸入，小鼠深度麻醉后迅速颈椎脱臼处死，取脑组织固定脱水包埋后，在冰冻切片机中自视交叉平面开始收片，连续切12张30 μm厚脑组织为1个循环，共连续切10个循环，各脑组织选相同3个循环的组织切片各1张，所选切片漂洗封闭后再分别在含有GFAP一抗(1∶400)、IBA-1一抗(1∶400)及MPO一抗(1∶200)的1%(质量浓度)BSA中4℃摇床过夜，之后用含有0.3%(体积浓度)Triton X-100的0.01 mol/L PBS洗涤后，在避光条件下，将组织切片置于含有相应二抗的1%(质量浓度)BSA室温孵育(均1∶300)；细胞核染色用DAPI再次洗涤后贴片封片并用荧光显微镜观察拍照及Image J软件定量统计每个200倍视野中GFAP、IBA-1及MPO的荧光强度，计算血肿的上、下、左、右4个视野每mm2中目标细胞的平均荧光强度，作为该切片中目标细胞的细胞数量。

1.2.6小鼠行为学评估：随机抽取4组小鼠各12只，于术后第1天、3天、7天、14天及28天，通过转角试验及改良神经功能缺陷评分表(NDS)[2]评估各组小鼠术后行为学情况，并记录总分。具体评分细则：其中每项评分为0～4分，0分表示正常，4分表示神经功能缺陷非常严重(表1)。

表1 NDS观察项目及评分细则

2 结果

2.1 小鼠死亡率假手术组及假手术+英夫利西单抗组无死亡，脑出血组小鼠死亡4只，脑出血+英夫利西单抗组小鼠死亡4只，死亡小鼠均在术后的第1天及第2天死亡，考虑该死亡率为造模导致的正常死亡率，与是否使用英夫利西单抗关系不大。

2.2 小鼠的体重及肛温四组小鼠术后体重略下降，但很快呈正常生长发育趋势，四组小鼠间体重变化差异无统计学意义(P>0.05)；术后四组小鼠肛温并无明显变化且均在正常范围内，四组小鼠间肛温变化差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组小鼠脑出血周围组织炎症因子及c-Jun N末端激酶通路相关蛋白表达术后第1天，与假手术组小鼠相比，脑出血组血肿周围TNF-α、IL-1β、IL-6表达明显升高，假手术+英夫利西单抗组TNF-α、IL-1β、IL-6表达降低(P<0.05)；与假手术+英夫利西单抗组相比，脑出血+英夫利西单抗组小鼠术后第1天血肿周围TNF-α、IL-1β、IL-6的表达明显升高(P<0.05)；与脑出血组相比，脑出血+英夫利西单抗组小鼠术后第1天血肿周围TNF-α、IL-1β、IL-6的表达有所降低(P<0.05)。这表明英夫利西单抗可能通过下调TNF-α、IL-1β、IL-6表达减轻脑出血后血肿周围炎症反应。具体见图1、表2。

注：IL-6：白细胞介素6；IL-1β：白细胞介素1β；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；ACTIN：内参图 1 四组小鼠脑出血周围组织炎症因子表达永图(Western blot)

2.4 各组小鼠脑含水量比较术后第3天，各组小鼠手术侧(左侧)大脑半球含水量差异有统计学意义(P<0.05)，非手术侧大脑半球(右侧)和小脑的含水量比较差异均无统计学意义(P>0.05)；与假手术组小鼠相比，脑出血组、脑出血+英夫利西单抗组脑出血侧(左侧)的含水量均明显增高(P<0.05)；与假手术+英夫利西单抗组及相比，脑出血+英夫利西单抗组小鼠术后第3天脑出血侧(左侧)的含水量均明显增高(P<0.05)；与脑出血组相比，脑出血+英夫利西单抗组小鼠术后脑出血侧(左侧)的含水量减轻(P<0.05)。结果见表3。

表2 各组小鼠脑出血周围炎症因子相对表达 水平比较

表3 各组小鼠术后第3天脑含水量比较

2.5 脑出血小鼠血肿部位周围小胶质细胞、星形胶质细胞的活化和中性粒细胞浸润情况术后第3天，脑出血组及脑出血+英夫利西单抗组小鼠术后血肿周围均有星形胶质细胞、小胶质细胞的活化及外周血中中性粒细胞的浸润，如图2所示，其中GFAP、IBA-1及MPO均被染为红色荧光。与脑出血组相比，脑出血+英夫利西单抗组小鼠血肿周围活化的星形胶质细胞、小胶质细胞及外周血中中性粒细胞的浸润数量有所减少(P<0.05，表4)。上述结果表明英夫利西单抗可减少脑出血小鼠脑部血肿周围的星形胶质细胞、小胶质细胞的活化及外周血中中性粒细胞的浸润。

表4 脑出血小鼠血肿周围活化的星形胶质细胞、小胶质细胞及外周血中中性粒细胞荧光强度比较

2.6 各组小鼠神经功能缺损评分结果具体见表5。四组各组小鼠术后第1天、3天、7天、14天和28天的NDS评分总分比较差异均有统计学意义(P<0.05)。假手术组第7天及第28天较第1天比较有统计学意义(P<0.05)，假手术+英夫利西单抗组第7天、第14天及第28天较第1天比较有统计学意义(P<0.05)，两组术后NDS评分整体呈快速恢复趋势。脑出血组及脑出血+英夫利西单抗组小鼠NDS评分总分在术后第1天最高，第3天、7天、14天和28天的NDS评分均较第1天呈逐渐减低趋势(P<0.05)，呈稳步恢复的状态。与假手术组小鼠相比，脑出血组、脑出血+英夫利西单抗组术后第1天、3天、7天、14天和28天的NDS评分总分明显增高(P<0.05)；与假手术+英夫利西单抗组相比，脑出血+英夫利西单抗组小鼠术后第1天、3天、7天、14天和28天的NDS评分总分明显增高(P<0.05)。与脑出血组相比，脑出血+英夫利西单抗组小鼠术后第3天、7天及14天的NDS评分总分比较有所降低 (P<0.05)，第1天及28天的NDS评分总分差异无统计学意义(P>0.05)，在第28天，脑出血+英夫利西单抗组的NDS评分虽与脑出血组相比无统计学差异，但英夫利西单抗组仍有一定程度减低，病情有好转趋势，后续治疗效果尚不明确，需增加观察时间。

注：GFAP：胶质纤维酸性蛋白；IBA-1：钙离子接头蛋白；MPO：髓过氧化物酶图 2 脑出血小鼠血肿部位周围小胶质细胞、星形胶质细胞的活化和中性粒细胞浸润情况(免疫荧光×200)

表5 各组小鼠NDS评分比较

3 讨论

脑出血作为一个世界性的健康难题，具有高致残率与高死亡率的特点，现今的原发性治疗方法包括神经保护剂、调控血压目标值、止血药物和微创手术等，这些治疗方法都不能完全解决脑出血早期脑损害，患者总体预后较差。由于目前针对原发性脑损伤的大型临床试验未取得预期的效果，研究脑出血继发性损伤成为关注的焦点[4]。因此，进一步深入对脑出血损伤机制的研究，寻找安全有效治疗脑出血的方法意义重大，探索脑出血新的治疗领域仍有必要。已有研究表明，TNF-α、IL-1β及IL-6等炎症因子都影响了脑出血急性期的病理生理过程[3]。英夫利昔单抗是一种嵌合单克隆抗体也是一种抗TNF-α的生物药物，其可通过阻断c-Jun N-末端激酶通路，进一步降低IL-1β及IL-6[17]等炎症因子的释放。

英夫利昔单抗已广泛应用于炎症性肠病、多发性硬化、急性移植物抗宿主病、急性肾小管间质性肾炎等自身免疫性疾病的治疗[5-8]。已有研究证实，其能够通过显著减弱小胶质细胞的迁移，降低TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达来发挥神经保护作用[3]。但其在脑出血中的应用尚未有研究报道，因此，本研究对其进行探索。

本研究结果显示，与脑出血组相比，脑出血+英夫利西单抗组小鼠血肿周围TNF-α、IL-1β、IL-6表达有所降低，脑出血+英夫利西单抗组小鼠脑部血肿周围的小胶质细胞、星形胶质细胞的活化及外周血中中性粒细胞的浸润数量减少，即英夫利西单抗可能通过减轻脑出血小鼠脑部早期炎症因子的渗出及血肿周围的星形胶质细胞、小胶质细胞的活化、外周血中中性粒细胞的浸润而对小鼠脑出血早期的病理生理过程有一定的改善。与脑出血组相比，脑出血+英夫利西单抗组小鼠第1天、第28天的NDS评分总分差异均无统计学意义，但术后第3天、第7天、第14天的NDS评分总分相比脑出血组有所降低，而第28天NDS评分虽无统计学差异，但仍有一定程度减低，病情有好转趋势，最终治疗效果尚需增加观察时间。

脑出血引起的脑损伤包括出血早期血肿机械压迫和占位效应造成的原发性损伤，以及免疫炎症、自由基等引起的继发性损伤[4]。TNF-α、IL-1β及IL-6属于前炎症细胞因子，通常是由炎症、肿瘤细胞和其他受损组织刺激巨噬细胞而产生，具有促进炎症细胞黏附、浸润的作用，在脑出血急性期的病理生理过程有一定的影响[3]，英夫利西单抗可能会通过降低TNF-α、IL-1β及IL-6而减轻脑出血急性期的炎症反应，降低脑出血小鼠急性期神经功能损害，进而改善脑出血的预后。小胶质细胞是脑内广泛分布的固有免疫细胞，占中枢神经系统细胞总数的10%，与脑出血后炎性反应密切相关[9、10]，小胶质细胞作为大脑最主要的免疫细胞，可以对大脑的损伤迅速作出反应[11]。已有研究表明，小胶质细胞有助于炎症微环境的产生[12-14]，在脑的炎症反应中，小胶质细胞一般起主导作用，星形胶质细胞和中性粒细胞起辅助作用，英夫利西单抗可能会通过减轻脑出血血肿周围的小胶质细胞、星形胶质细胞的活化及外周血中中性粒细胞的浸润而对脑出血早期有一定改善作用，促进神经功能的恢复。

对于急性脑出血的治疗，在临床实践和试验中针对血肿周围水肿、炎症、神经保护等，最近的一项数据荟萃分析显示，血肿扩大与从症状发作到基线成像的时间、基线成像时的脑出血量和早期的抗炎治疗显著相关[15]。高达47%的患者在最初出血后的某个阶段恶化，但大多在最初的24 h内[16]，因此脑出血患者的早期治疗显得至关重要。英夫利西单抗可通过降低TNF-α、IL-1β及IL-6等炎症因子的渗出，减轻血肿周围的小胶质细胞、星形胶质细胞的活化及外周血中中性粒细胞的浸润对脑出血早期的治疗提供一些指导。

综上，本研究结果显示英夫利昔单抗在小鼠脑出血治疗中具有一定潜力。本研究使用英夫利昔单抗干预脑出血小鼠模型，发现其可引起脑血肿周围炎症因子表达下降、小胶质细胞活化数量降低，对小鼠神经功能具有改善作用，推测其可能通过减轻炎症因子渗出及炎症细胞浸润而对脑出血早期有一定治疗的作用。但未来英夫利西单抗应用于脑出血的临床治疗，仍需进一步的动物实验及临床试验探讨。