桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎的网络药理学研究

敖菲，李海英

陕西中医药大学第一附属医院中医妇科，陕西 咸阳 712000

盆腔炎性疾病（pelvic inflammatory disease，PID）是妇科常见病、多发病，多见于月经期妇女，是由于感染引起的女性上生殖道炎症，临床以腹痛为主要表现，短期可诱发输卵管、卵巢和盆腔脓肿，长期可诱发异位妊娠、不孕和慢性盆腔疼痛［1-2］。目前抗生素是治疗盆腔炎的主要药物［3］。研究发现，早期盆腔炎使用抗生素可基本痊愈，但慢性盆腔炎应用抗生素治疗具有明显局限性［4］。随着临床研究的不断深入，人们发现抗生素联合桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎疗效显著［5-11］。

桂枝茯苓胶囊是目前临床应用较为广泛的中药制剂，始载于《金匮要略》，由桂枝、桃仁、牡丹皮、白芍、茯苓组成，方中以桂枝为君，桃仁为臣，牡丹皮、白芍、茯苓为佐，具有活血化瘀、缓消癥结的功效［12］，临床被广泛用于治疗盆腔炎性疾病。研究发现桂枝茯苓胶囊可缓解盆腔炎性疾病引起的下腹疼痛，缩小盆腔炎性包块等症状、体征［13-16］。然而桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎的主要活性成分和作用机制研究仍面临诸多挑战。

网络药理学方法是基于系统生物学理论构建药物-靶点-疾病相互作用网络，分析药物在各网络模块中与特定节点间的相互作用，从系统性、整体性角度探究药物与潜在靶点间的作用关系的方法［17-18］。本研究以网络药理学方法为切入点，探讨桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎的有效活性成分及作用靶点，揭示其分子作用机制，对桂枝茯苓胶囊科学内涵的阐释及临床推广具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 桂枝茯苓胶囊化学成分筛选运用中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）探索桂枝茯苓胶囊中各单味药化学成分，根据研究结果，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（Druglikeness，DL）≥0.18为限制条件进行筛选，得到桂枝茯苓胶囊的生物活性成分。

1.2 化学成分对应靶点库和盆腔炎相关靶点库构建通过TCMSP数据库检索桂枝茯苓胶囊中各单味药化学成分靶点，将其靶点与Uniprot数据库中各靶点人类基因简称进行查询，获得桂枝茯苓胶囊可能存在的靶点；使用人类基因综合数据库GeneCards（https：//www.genecards.org）以“Pelvin Inflammatory”为检索词，获得盆腔炎相关靶基因。

1.3 药物-疾病交集靶基因及药物-化学成分-靶点-疾病网络构建在R中安装VennDiagram包，获得桂枝、桃仁、白芍、茯苓、牡丹皮活性成分与盆腔炎相关靶点的韦恩图和交集基因。使用Cytoscape 3.7.2构建药物-化学成分-靶点-疾病网络。

1.4 靶蛋白相互作用网络构建及关键靶点筛选将药物-疾病交集靶点基因导入String（https：//string-db.org）进行相互作用蛋白查询并构建蛋白质互作网络（protein-protein interaction networks，PPI），物种设置为“人（Homo sapiens）”，最低相互作用评分设置为中等置信度“medium confidence（0.400）”，设置隐藏不连接的节点，其余参数保持默认设置，得到桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎的靶蛋白网络。运用Perl脚本筛选出PPI网络中的关键靶蛋白。

1.5 基因本体论富集分析（gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书GO与KEGG（kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG）通路富集分析主要用于注释基因功能，包括细胞功能、分子功能和生物功能，已被广泛应用于生物基因功能分类。运用基因本体数据库Bioconductor对桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎的靶基因进行GO和KEGG通路富集分析，研究桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎的主要生物过程和代谢通路。

2 结果

2.1 桂枝茯苓胶囊活性成分及靶点通过TCMSP数据库，共筛选出桂枝茯苓胶囊有效成分69个，其中桂枝7个，白芍13个，茯苓15个，桃仁23个，牡丹皮11个。69个有效成分对应4364个相关靶基因。通过Uniprot对靶点和基因信息标准化并去重最终获得靶基因177个。见附表1。

2.2 盆腔炎相关靶点在Genecards数据库获得4253个盆腔炎相关基因。

2.3 药物-疾病靶点将桂枝茯苓胶囊177个作用靶点与4253个盆腔炎靶点基因进行韦恩分析，获得药物-疾病交集基因136个，见图1。

图1 桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎靶点韦恩图

2.4 药物-化学成分-靶点-疾病”网络借助Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-化学成分-靶点-疾病”网络，共有171个节点（化合物35个，靶点136个），见图2。

图2 桂枝茯苓胶囊-化学成分-靶点-盆腔炎网络

2.5 PPI网络分析及核心基因筛选将136个药物-疾病交集靶点通过String数据库进行PPI网络分析，运用Perl脚本统计蛋白相互作用节点，将连接节点前30位基因进行可视化，由图可知，桂枝茯苓胶囊主要通过调控靶基因v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物1（v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1，Akt1），白细胞介素6（interleukin 6，IL-6），血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA），胱天蛋白酶3（recombinant Caspase 3，CASP3），JUN原癌基因（jun proto-oncogene，JUN），髓细胞组织增生病毒癌基因（myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog，MYC），表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF），前列腺素内过氧化物合成酶2（prosta-glandin-endoperoxide synthase2，PTGS2），雌激素受 体1基因（estrogen receptor1，ESR1），促分裂原活化蛋白激酶1（Mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1），促分裂原活化蛋白激酶8（mitogenactivated protein kinase 8，MAPK8），白细胞介素1B（interleukin 1B，IL1B），基质金属肽酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP9），周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1），FOS基因（fos protooncogene，FOS），热休克蛋白90Daα（heat shock protein 90kDa alpha，HSP90AA1），趋化因子（C-C基元）配 体2（chemokine（C-C motif）ligand 2 CCL2），基质金属肽酶2（matrix metallopeptidase 2，MMP2），过氧化氢酶（catalase，CAT），白血病病毒癌基因同源物2（erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2，ERBB2），人V-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A（human V-Rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，RELA），雄激素受体（androgen receptor，AR），细胞间黏附因子1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1），胱 天 蛋 白 酶8（recombinant caspase 8，CASP8），一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3），过氧化物酶体增生激活受体γ（peroxisome proliferative activated receptor，gamma，PPARG），丝氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子，进化枝E（微管连接蛋白，纤溶酶原激活因子抑制因子型1），成员1（serpin peptidase inhibitor，clade E（nexin，plasminogen activator inhibitor type 1），member 1，SERPINE1），BCL2样1（BCL2-like 1，BCL2L1），血红素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）抑制盆腔炎的发生发展。见图3。

图3 桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎核心基因

2.6 GO功能分析通过Bioconductor数据库对桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎的136个靶基因进行GO富集分析。结果显示桂枝茯苓胶囊主要与脂多糖、细菌来源分子、金属离子、抗生素、活性氧、类固醇激素等结合。细胞定位结果显示桂枝茯苓胶囊主要集中在包膜、细胞质囊泡、核染色质等方面。见图4—5。

图4 桂枝茯苓胶囊-盆腔炎靶点的GO富集分析“生物学功能”（前20）

分子功能结果显示桂枝茯苓胶囊主要通过调控DNA结合转录因子激活、RNA聚合酶Ⅱ转录因子特异性、泛素样蛋白连接酶结合、激酶调节活性、核受体活性、RNA聚合酶转录因子结合、类固醇受体活性、氧化还原酶活性、组蛋白激酶活性影响疾病进程。见图6。

图6 桂枝茯苓胶囊-盆腔炎靶点的GO富集分析“分子生物学功能”（前20）

2.7 KEGG通路富集分析通过Bioconductor数据库对桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎的136个靶基因进行KEGG富集分析，筛选出158条信号通路，选取前20条信号通路，可以看出，桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎的靶点主要参与AGE-RAGE糖尿病并发症、前列腺癌、动脉粥样硬化、疱疹病毒感染、乙型肝炎、丙型肝炎、TNF信号、IL-17等信号通路。见图7。

图7 桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎通路信息柱状图

2.8 基因-通路”网络构建借助Cytoscape 3.7.2软件将桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎的136个靶基因及前20条通路进行可视化处理，构建“基因-通路”网络，网络中共有171个节点（靶点136个，通路20个），其中度值表示连接到1个节点的线条数，用来评估网络中每个节点的重要性。节点越大表明度值越大。见表2，图8。

图8 桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎关键靶点参与的通路富集信息

表2 桂枝茯苓胶囊活性成份治疗盆腔炎通路基本信息（前20条）

图5 桂枝茯苓胶囊-盆腔炎靶点的GO富集分析“细胞学组分”（前20）

3 讨论

本研究采用网络药理学方法构建桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎的“药物-化合物-作用靶点-疾病”网络，得到35个活性成分，136个靶基因，158条信号通路。主要涉及靶基因Akt1、IL-6、VEGFA、CASP3、Jun、MYC、EGFR、EGF、PTGS2、ESR1、MAPK1、MAPK8、IL-1，IL-1B、MMP9、FOS等。GO富集和KEGG通路富集结果提示，AGE-RAGE糖尿病并发症信号通路、前列腺癌通路、动脉粥样硬化通路、疱疹病毒感染通路、乙型肝炎通路、丙型肝炎通路、TNF信号通路、IL-17信号通路可能与桂枝茯苓胶囊干预盆腔炎的作用机制一致。其中，AGE-RAGE主要通过诱发氧化应激作用于下游JNK、ERK1/2、Akt以调控炎性因子释放。TNF信号通路主要通过作用于下游JNK、ERK干预炎性因子释放。IL-17信号通路主要通过调控下游MAPK诱发炎性因子释放。乙型肝炎、丙型肝炎主要通过PI3K/Akt和细胞凋亡途径诱发细胞损伤。可见，PI3K/Akt、MAPK信号通路广泛分布于各种细胞且在桂枝茯苓胶囊干预盆腔炎的过程中起关键作用。桂枝茯苓胶囊可通过激活PI3K/Akt、MAPK信号通路抑制盆腔组织炎性因子及凋亡因子释放。LI等［19］发现Akt、MAPK、1L-1β及IL-6在盆腔炎中高表达，提示Akt、MAPK诱发的炎症反应途径是盆腔炎的重要发病机制。研究发现Caspase-3在盆腔炎患者中高表达［20-21］，提示细胞凋亡是盆腔炎的重要发病机制。

综上所述，盆腔炎是以结构和功能改变为特征的多因素疾病，越来越多的研究证实中药治疗盆腔炎的有效性。探究中药治疗盆腔炎的作用靶点及作用机制对于盆腔炎的防治至关重要。本研究通过生物信息学和网络药理学方法对桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎的主要生物活性成分及其药理作用机制进行了分析，证实桂枝茯苓胶囊可能主要通过PI3K/Akt及MAPK信号通路抑制氧化应激、炎症反应、细胞凋亡，从而减轻盆腔炎。