烟曲霉相关基因、转录因子在其细胞壁重塑、稳态和生长定位中的作用

高飞飞 马彦

(山西医科大学第二医院皮肤性病科，太原 030000)

烟曲霉(Aspergillusfumigatus)是一种腐生的丝状真菌，其营养菌丝存在于土壤、空气和有机物质中，是免疫功能严重受损患者最常见的感染性死亡原因之一。烟曲霉细胞壁是一个动态的结构，这种动态结构成为其对抗环境的主要防线[1]。由于支持烟曲霉生长和繁殖的自然过程的变化或者所处环境应激反应，其细胞壁会经历持续的生物合成和重塑[2]。研究发现，许多基因可通过改变细胞壁成分含量而使细胞壁结构重塑。烟曲霉分生孢子的形成也会伴随着孢子细胞壁的重塑[3-4]。另外，相关基因、转录因子会控制细胞壁的生物合成，调节烟曲霉细胞壁的稳态[5-6]。分生孢子发展形成菌丝的过程、基因的正确定位对烟曲霉的致病相当关键[7]。抵抗宿主环境压力的机械强度主要由其细胞壁提供，所以细胞壁的破坏对菌丝形态有深远的影响。鉴于烟曲霉细胞壁在真菌生理学中的重要作用，它被认为是抗真菌药物的一个极好的靶点。

1 参与细胞壁重塑的相关基因、蛋白

烟曲霉细胞壁90%以上为多糖，主要由β-(1，3)-葡聚糖、α-(1，3)-葡聚糖、半乳甘露聚糖、几丁质组成[1]。但是在烟曲霉不同形态中，其细胞壁成分还是有区别的。半乳糖氨基半乳聚糖在菌丝细胞壁中存在，而黑色素和疏水小棒状蛋白在分生孢子细胞壁中存在[8]。

1.1 与细胞壁成分相关的基因、蛋白

β-(1，3)-葡聚糖 β-(1，3)-葡聚糖占多糖部分20%～35%，存在于线性分生孢子链的分生孢子连接处，由质膜结合葡聚糖形成的酶复合物，同时使用UDP-葡萄糖作为底物，并通过质膜将线性β-(1，3)-葡聚糖链挤出，进入胞质[8]。当到达胞质时，线性β-(1，3)葡聚糖被重塑，与预先存在的细胞壁成分结合。β-(1，3)-葡聚糖延伸分支是烟曲霉细胞壁构建过程中的重要步骤[9]。

①烟曲霉GH16家族β-(1，3)-葡聚糖酶是分生孢子细胞壁形成的必需酶。在烟曲霉中，只有Eng1p和Eng2p被鉴定为内切β-(1，3)-葡聚糖酶，占总内切β-(1，3)葡聚糖酶活性的十分之一。它可以裂解可溶性和不溶性β-(1，3)-葡聚糖，并可以直接作用于整个细胞壁中的β-(1，3)-葡聚糖聚合物，导致烟曲霉分生孢子细胞壁在延伸过程中β-(1，3)-葡聚糖含量减少，使分生孢子细胞壁发生重塑。且在β-(1，3)-葡聚糖酶的多重缺失突变体Δeng1,2在分生孢子膨胀期间显示出异常形态，表明GH16家族β-(1，3)-葡聚糖酶对于其分生孢子细胞壁重塑有很大的作用[3]。其他的内切β-(1，3)-葡聚糖酶家族成员(GEL家族,GH55、GH17糖基转移酶)在分生孢子萌发过程中的细胞壁重塑也扮演着重要角色[10]。②GPI锚定的β-(1,3)-葡聚糖转移酶家族在烟曲霉细胞壁葡聚糖延伸过程中发挥了重要作用[11]。葡聚糖的延伸是通过β-(1，3)-葡聚糖转移酶的作用进行的。其中编辑β-(1,3)-葡聚糖转移酶的基因rhoA主要作用是催化GPI锚合成，敲除该基因会导致GPI连接蛋白的缺失，使突变株孢子萌发提前,细胞自溶，细胞壁变厚，使β-(1，3)-葡聚糖含量增加。它在细胞壁中的重塑作用主要是通过潜在的糖基化位点进行的[12]。

几丁质 几丁质占细胞壁多糖成分的7%～15%，它是通过β-(1，4)-连接到β-(1，3)-葡聚糖的非还原端而形成的，乙酰化程度在50%或50%以上的聚合物通常称为几丁质，是烟曲霉细胞壁的少数成分[7]。

MADS-Box转录因子RlmA可调节MpkA磷酸化，是编码细胞壁生物几丁质合成酶的基因的转录激活所必需的[13]。有研究显示：通过dectin-1染色分析了Δr1mA菌丝细胞壁中的含量，发现R1mA缺失菌株中几丁质含量增加，细胞壁酶促水解增强，生物膜形成减少，进而可引起细胞壁结构的重塑[14]。此外，RlmA在无性分化过程中参与细胞壁合成和重塑的基因表达,包括flbB、flbC、brlA、abaA和rasB，还可以影响气生菌丝中几丁质的含量[4]。

α-(1，3)-葡聚糖 在烟曲霉中，α-(1,3)-葡聚糖分别占菌丝体和分生孢子细胞壁多糖的40%和19%。它是一种主要的黏合剂，参与萌发的分生孢子的聚集和生物膜的形成[15]。在基因组中发现了大量能够修饰α-(1，3)-葡聚糖链的α-(1，3)-葡聚糖酶的相关基因,如AGS[16]。AGS基因的缺失导致分生孢子细胞壁的广泛结构修饰，特别是分生孢子表面，疏水小棒状蛋白被无定形糖蛋白基质覆盖，会引起细胞壁重组[17-18]。

半乳甘露聚糖 半乳甘露聚糖由线性甘露聚糖主链和半乳糖呋喃侧链组成。DFG家族(包含DGF1/2/3/4/5/7等)是参与细胞壁重塑的酵母和丝状真菌共有的4个GPI锚定蛋白家族之一。它对于半乳甘露聚糖插入烟曲霉细胞壁是绝对必要的，且在细胞壁适当的定位对于烟曲霉的正确形态发生也是必需的。其中DFG3最为重要，在Δdfg3和含有dfg3缺失的多基因缺失突变体中，其细胞壁中半乳甘露聚糖的含量大大缺失，分生孢子生长率下降。正是由于它的缺失会导致半乳甘露聚糖插入细胞壁的功能缺陷，进而有助于分泌蛋白通过细胞壁释放，从而导致细胞壁结构的重塑[19]。

1.2 GPI锚定蛋白

在真菌中，许多GPI锚定蛋白(GPI-AP)参与细胞壁聚合物的重塑[20]。GPI锚定的蛋白质通过高尔基体从内质网运输到质膜，GPI锚作为在分泌和内吞途径中转运GPI锚定蛋白质的分类信号，当GPI附着到蛋白质后，GPI锚的结构被重塑，从而调节GPI锚定蛋白质的运输和定位[21]。GPI脂质重塑蛋白(称为PerA)缺失会影响GPI的合成，进而影响细胞壁的合成[22]，在PerA缺失菌株中，几丁质和β-葡聚糖含量减少，进一步导致其细胞壁重塑[23]。

2 调节细胞壁稳态的相关基因、转录因子

2.1 通过改变细胞壁多糖成分调节细胞壁稳态

转录因子SomA与酿酒酵母转录因子Flo8类似，在烟曲霉细胞壁稳态有着重大作用。尤其是对细胞壁多糖的生物合成有着直接调节作用，对于维持正常的细胞壁结构和组成也是必需的。研究发现，与野生株相比，ΔsomA菌株细胞壁β-(1,3)-葡聚糖量减少了50%，从而导致细胞壁稳定性下降。其次，表达谱和全基因组染色质免疫沉淀(ChIP)显示SomA可正向调节细胞壁稳态相关基因(如medA、wsc3)的表达[24]。

2.2 通过调节几丁质酶活性调节细胞壁稳态

在烟曲霉中海藻糖生物合成基因的缺失显著改变了细胞壁的结构和完整性。海藻糖合酶调节亚基同源物TslA和TslB：TslA通过与CsmA(几丁质合酶)互相作用来负向调节几丁质合成酶活性，还可以影响CsmA的细胞定位。在野生型烟曲霉中，CsmA主要定位于生长中的菌丝顶端和隔膜，相比之下，ΔtslA菌株中CsmA的定位沿着菌丝的一侧细胞壁和整个细胞质分散，并且在空间上不限于菌丝尖端或隔膜。TslA的缺失通过改变CsmA的定位导致几丁质合酶活性的失调，由于几丁质合酶对细胞壁稳态至关重要，所以TslA可能通过影响CsmA的错误定位导致细胞壁稳态破坏。其次，TslA还可以通过破坏菌丝细胞壁中几丁质和β-葡萄糖的平衡、降低分生孢子和菌丝体中海藻糖的含量，引起细胞壁稳态的改变[25-26]

3 通过定位影响烟曲霉生长的相关基因、蛋白

3.1 定位于菌丝顶端隔膜的相关基因、蛋白

钙调神经磷酸酶：烟曲霉钙调神经磷酸酶催化(CnaA)和调节(CnaB)亚单位复合体在隔膜上的正确定位对于烟曲霉菌丝生长非常重要[27]。CnaA和CnaB在隔膜处的定位是相互依赖、共同发挥作用的。其复合体通常在隔膜形成过程的早期形成，对隔膜的形成和维持起主要作用。钙调神经磷酸酶通过围绕隔膜孔形成一个圆盘定位于在菌丝隔膜的两侧来调节菌丝生长。其中一些残基的突变会导致钙调神经磷酸酶在菌丝隔膜处的错误定位，进而导致细胞壁缺陷，让菌丝的生长与延伸受到影响[28-300]。

3.2 定位于质膜的相关基因、蛋白

Ras蛋白是质膜相关的GTPases，它在质膜上的正确定位对于感染过程中侵入性菌丝的形成至关重要[31]。在烟曲霉中，产生两种Ras蛋白:一种与人类HRas高度相似，命名为RasA，另一种命名为RasB，仅由丝状真菌在质膜上产生，烟曲霉菌丝的萌发和菌态发生的协调，取决于其在质膜上的正确定位。棕榈酰化在RasA定位中起主要作用，棕榈酰脂质部分的存在使RasA-质膜结合的稳定性增加了几倍。但是它的基因序列靶向突变使RasA在质膜上错误定位，导致菌丝形态、细胞壁发生缺陷。在裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)中，RasA棕榈酰化基序敲除后，其定位仅限于内膜，在内膜中与鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF) Efc25p相互作用，并通过Cdc42介导的途径发出信号以控制细胞形态[32-34]。

GPI锚定蛋白：糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白在真核生物中普遍存在，主要存在于富含甾醇和鞘脂的特殊微结构域的质膜中[35]。由核心结构组成的GPI前体会预先附着在PI上的质膜上，且每个核心甘露糖上带有一个EtNP残基，在GPI锚上添加第二个甘露糖的EtN-P对于细胞壁GPI定位是必需的，但是在GPI锚的第二个甘露糖残基上缺乏EtN-P并不影响细胞壁合成所需的GPI-PMPs(质膜GPI锚定蛋白)的定位，但是添加EtN-P对于GPI-CWPs(细胞壁GPI锚蛋白)的定位至关重要[36-37]。

3.3 定位于高尔基体的相关基因、蛋白

糖基转移酶家族clpA：是一种414个氨基酸长的蛋白质，具有高尔基体定位糖基转移酶典型的第二类跨膜拓扑结构，一种参与荚膜形成和毒性的假定的糖基转移酶。研究发现，该基因定位于烟曲霉高尔基体。clpA基因的靶向缺失会导致GPI锚的生物合成，影响它在高尔基体的正确定位，进一步造成烟曲霉细胞壁缺陷、菌丝生长异常[38]。

4 小 结

近年来，免疫抑制剂等药物在临床上的广泛使用，导致机会性致病菌烟曲霉感染率不断上升，由于抗真菌药物的不规范使用以及环境中唑类杀菌剂的暴露，烟曲霉对抗真菌药物(尤其为唑类药物)的耐药性迅速增加。所以新的抗真菌药物的发掘迫在眉睫。目前，细胞壁作为药物开发的理想目标，人们对它的研究在不断深入，了解其发病的机制，特别是细胞壁的重塑及正确定位尤为重要。