复发性外阴阴道念珠菌病的免疫学研究新进展

阮丽君 朱玲 徐晓武 李婉玲 罗颂平

(1.南方医科大学第五附属医院妇科，广州 510900; 2.广州中医药大学第一附属医院妇科，广州 510405)

1 复发性外阴阴道念珠菌病的概况

复发性外阴阴道念珠菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis,RVVC)是指一年内有症状并经真菌学证实的外阴阴道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)发作4次或以上者[1]。Blostein[2]等对7个国家RVVC新患病例数展开调查，发现RVVC的发病率居于14%～28%(平均23%)。RVVC的高发病率说明RVVC是一种常见病。有些患者无明显易感因素却反复发作，RVVC严重影响了患者的生活质量、心理健康和性生活[3]，RVVC患者躯体功能、角色生理、躯体疼痛、一般健康、活力、社会功能、角色情绪、心理健康SF-36维度的平均分值显著低于对照组，RVVC患者的生理、心理综合评分均明显低于对照组(P<0.05)[4]。RVVC不仅给患者带来精神、心理压力，也给社会增加了经济负担。故我们需要重视RVVC的防治，积极寻找RVVC的危险因素。

2 RVVC免疫学研究进展

目前，关于RVVC的发病机制尚存在一定的争议。近年来，多项研究指出，其主要与阴道局部免疫及中性粒细胞“失能”等有关。本文就RVVC发病的免疫学机制研究进展作一综述。

2.1 阴道上皮细胞在RVVC发病中的作用

人体的黏膜屏障是免疫、化学和机械应力的保护，固有层是黏膜免疫系统的一个重要部分。阴道上皮天然免疫分子的分泌水平会随着月经周期呈现出周期性的动态变化，在卵泡期主要呈现上调，而在黄体期则主要呈现下调[5]。阴道上皮细胞通过直接与念珠菌接触进而产生生长抑制活性，提供了适度而重要的一线保护作用[6]。这种上皮细胞所介导的杀菌反应既能杀灭真菌，产生炎症反应，也能促进无症状共栖[7]。既往无RVVC病史的妇女其阴道上皮细胞表现出对念珠菌的生长具有抑制作用，这也表明了阴道上皮细胞在宿主阴道免疫防御中的积极作用[8-9]。阴道黏膜在局部免疫反应中具有潜在的功能，育龄期妇女阴道黏膜的淋巴细胞密度受性激素水平的影响呈周期性改变[10]。RVVC缓解期女性阴道局部产生较高水平的IL-12和IFN-γ，可能RVVC患者阴道局部存在异常的免疫应答，从而使阴道黏膜上皮组织防御功能受影响[11]。RVVC发作期妇女阴道局部处于“亢奋”状态，Th1细胞抵御念珠菌作用过度，同时Th2细胞效应增强，共同作用使阴道局部过敏、损伤[12]。推测RVVC反复发作，可能由于阴道黏膜对真菌成分致敏，反复激活局部免疫，导致阴道黏膜微环境破坏而难以修复，病程缠绵。

2.2 全身性适应性免疫在RVVC中的作用

近来诸多动物和临床试验表明，全身适应性免疫及相关的细胞因子在预防阴道炎中作用不大[13-14]。既往的研究认为VVC与其他部位的念珠菌病相似，均存在适应性免疫反应缺陷，但是VVC或RVVC在CD4+T细胞减少的HIV妇女中的发病率并没有升高[15]。这种现象在小鼠实验中也得到证实，全身性适应性免疫对此并无明显保护作用[13-14]。说明全身性适应性免疫在RVVC中的作用并不大，可能阴道局部免疫发挥着更大的作用。

2.3 固有免疫在RVVC发病中的作用

固有免疫在抵御念珠菌感染及其易感性中起到重要的作用，阴道上皮细胞通过抑制白念珠菌的生长，将念珠菌定植水平限制在引发症状性感染所需的阈值以下，从而给机体提供一定程度的保护作用[9,16]。中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)是宿主抵抗白念珠菌感染的天然免疫防御的主要成分之一[16-17]，VVC与急性炎症反应密切相关，其特征是阴道内出现PMNs聚集，这有助于症状的发生，却不能清除念珠菌的感染[18]。念珠菌虽然可以激活先天免疫信号进而导致中性粒细胞募集进入阴道黏膜，但实验证据表明中性粒细胞聚集会放大炎症级联反应，却似乎不能减轻真菌的负荷，而免疫系统的过度反应，可能会对其造成一定的损伤。尽管阴道局部存在强烈的炎症反应，但越来越多的证据表明PMNs不能减轻真菌的负荷[18-19]，却使阴道黏膜处于慢性炎症状态[20]。单纯的真菌负荷不足以引起症状性感染，也不能完全解释VVC的易感性，因为阴道黏膜常被念珠菌定植却没有临床表现，有些女性阴道内念珠菌高度定植却不总是出现症状，反之亦然。

在VVC动物模型中70%以上的小鼠表现出高水平的PMNs浸润，但似乎没有减轻阴道真菌负荷[20]。国外一项临床研究发现，PMNs迁移只存在于那些阴道接种念珠菌后出现临床症状的患者身上[21]，与无症状定植(共栖)相比，阴道炎的症状与PMNs的存在有很强的相关性[20]，给无VVC病史的妇女即使接种很高浓度(>108)的念珠菌，真菌仍然不能较好地在其阴道内定植[21]。这也证实真菌负荷并非驱动疾病症状的唯一原因。说明阴道内的PMNs功能障碍可能是由于PMNs固有的缺陷，或者阴道环境中存在抑制其正常功能。

在慢性VVC易感女性中，念珠菌刺激阴道上皮细胞产生报警素和促炎细胞因子，诱导PMNs迁移，导致炎症环境和相关伴随症状[20,22]。不易感VVC妇女阴道上皮细胞不易对促炎细胞因子作出反应，而是以非炎症方式促进念珠菌的静态生长抑制，以维持共栖[20]。说明RVVC的发病可能由于阴道微环境中存在某些趋化因子诱导PMNs迁移，或者可能由于阴道上皮细胞受抗原刺激阈值降低，免疫反应亢进。

PMNs的抗真菌活性包括巨噬细胞1抗原(macrophage-1 antigen,Mac-1)与白念珠菌酸碱度调节抗原1蛋白(pH regulated antigen 1 protein,Pra1p)的相互作用。Mac-1高表达于中性粒细胞。Pra1p是一种念珠菌表面相关和分泌的蛋白质，存在于酵母态和菌丝态中，但在菌丝态中高度表达[23]。Pra1p可与Mac-1结合，介导人吞噬细胞的黏附和迁移。念珠菌Pra1p高表达菌株增强中性粒细胞迁移和黏附。缺乏Pra1p的白念珠菌突变株比野生型菌株支持中性粒细胞迁移的程度低。CD-1小鼠为VVC抵抗小鼠的代表，在接种念珠菌后不能维持定植，即使用菌丝缺失、菌丝缺陷甚至野生型念珠菌菌株在不同的接种浓度，阴道真菌负荷仍不受诱发的PMNs所影响[24]。C3h/Hen小鼠为VVC易感小鼠[25]。用生物膜缺陷的白念珠菌突变体与野生型白念珠菌感染阴道期间发现两者的定植率无明显差别[18]，说明PMNs功能障碍无法用念珠菌菌株生物膜形成来解释。CD-1小鼠接种念珠菌后的阴道涂片镜检显示：PMNs与念珠菌菌丝有密切接触，而C3h/hen小鼠的涂片则显示中性粒细胞与菌丝接触较少。在接种念珠菌菌种3 d后，易感小鼠及耐受小鼠均产生了急性炎症反应，然而，11 d后耐受小鼠的真菌负荷及PMNs均下降，而易感小鼠的各项参数仍然维持。故VVC抵抗小鼠阴道真菌负荷减少是可能由于PMNs反应和足够的抗真菌活性清除所致。易感小鼠的腹膜及阴道PMNs在体外与真菌之间表现出同等的杀菌能力。如将PMNs放置在易感小鼠阴道条件培养基(小鼠阴道灌洗液的无菌制备，阴道条件培养基可以很好地模仿易感小鼠的阴道环境)时，观察PMNs体外杀菌功能，发现阴道条件培养基下无论是腹膜还是阴道PMNs都不能发挥足够的杀菌能力。说明易感小鼠阴道环境中可能存在抑制因子影响PMNs抗真菌活性。其他能结合真菌多糖的C类凝集素受体Dectin-1、Toll样受体(toll-like receptor,TLR)2等白细胞受体也可能参与真菌识别，但它们不直接介导白细胞迁移、黏附、杀伤和吞噬。Dectin-1和TLR2仅识别白念珠菌的酵母形式[26]，它们在PMNs消除真菌方面可能仅起到很小的作用，而PMNs仅能杀死和/或吞噬白念珠菌的有害形式。VVC易感小鼠和VVC抵抗小鼠的实验对比，说明易感小鼠阴道微环境中存在一些抑制因子导致了PMNs功能障碍，抑制了其正常杀菌能力。

2.4 RVVC发病与整合素、硫酸乙酰肝素的关系

整合素是细胞黏附分子家族成员，主要通过介导细胞与细胞外基质间的“双向信号转导”来调控细胞的迁移、增殖和凋亡，参与机体的病理、生理过程。淋巴细胞功能相关抗原1(lymphocyte function-associated antigen-1,LFA-1)和巨噬细胞1抗原(Mac-1)及其受体，例如细胞间细胞黏附分子(intercellular cell adhesion molecules-1,ICAM-1)，连接黏附分子(junctional adhesion molecules,JAM-A)和晚期糖基化产物(receptors for advanced glycation end products,RAGE)的受体对于促进PMNs募集至关重要，但是Mac-1能更有效地诱导由内而外的信号传导[27]。PMNs的Mac-1受体是通过Pra1p在白念珠菌菌丝上的表达来识别真菌的关键性配体[23]，Mac-1具有结合多种配体和调节各种白细胞功能的能力[28]。Mac-1作为β2整合素家族中的重要一员，不仅能促进吞噬细胞的细胞毒作用和增强几种效应分子功能而发挥促炎作用。Fagerholm等[29]研究发现 Mac-1可介导中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞的吞噬作用。Mac-1与配体结合后介导细胞活化。活化后Mac-1由预先形成的胞质库迅速转移至细胞表面，从而使细胞表面 Mac-1上调[30]。Mac-1的信号转导特性对PMNs功能的具有调控作用。

硫酸乙酰肝素(heparin sulfate,HS)是多糖糖胺聚糖家族的一员，多糖广泛表达于哺乳动物组织的细胞表面和整个细胞外基质，包括阴道上皮[31]。HS蛋白聚糖的一条或多条HS链附着在细胞表面或细胞外基质蛋白上，由于链长的变化而具有显著的结构多样性[32]。研究表明，HS是PMNs活化所必需Mac-1的竞争性配体[33]，HS在小鼠阴道上皮细胞和人阴道上皮细胞均有表达[34]。基于小鼠与人免疫病理反应的相似性,有学者推测易感VVC或RVVC患者阴道分泌物中HS可能水平升高，同样也会通过对Mac-1的竞争性抑制来促进中性粒细胞无反应[35,20]。相反，那些既往没有VVC病史或者VVC抵抗的女性，要么阴道局部HS水平偏低，或者表达不同的HS亚型，要么在具有相似HS水平的情况下不能触发免疫致病性PMNs迁移。通过比较VVC易感和VVC抵抗小鼠的阴道局部反应，确定在易感小鼠阴道环境中存在的硫酸乙酰肝素作为PMNs上Mac-1的竞争性配体，有效地使PMNs不能与念珠菌结合以启动。因此，有症状的VVC/RVVC的结果被假定为依赖于一种由PMNs介导的免疫致病性反应，该反应涉及HS，可有效地将PMNs置于功能性无反应状态[36]。RVVC与免疫缺陷无关，与阴道局部强烈的免疫病理反应有关[36]。

2.5 RVVC发病与中性粒细胞胞外陷阱关系

Mac-1介导的PMNs激活被证实能通过形成中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)促进真菌的杀灭[23]。PMNs活化后发生氧化性爆发，导致其颗粒物质(组织蛋白酶G和弹性蛋白酶)释放到细胞外空间，随后产生NETs。NETs作为继中性粒细胞吞噬、分泌相关细胞因子以及脱颗粒等作用之后的新型有效的抗菌屏障，能够调节生理性的免疫防御，限制感染的扩散[37]。当机体受到病原微生物入侵时，NETs可借助于其特殊的以DNA为主体的纤维丝网状结构来快速、有效地捕获病原体，限制炎症扩散，发挥强大的免疫防御等功能[38]。NETs不仅能抵御微生物，还可通过激活释放至细胞外的细胞因子来直接调节炎症，是IL-1家族细胞因子激活的局部平台。NETs结合的蛋白酶具有酶促活性，可以加工和激活IL-36α、IL-36β和IL-36γ以及IL-1α，以增强其促炎潜能[39]。IL-1包括IL-1α、IL-1β和IL-1γ三个成员，主要由活化的巨噬细胞产生，IL-1具有广泛的生物学作用：促进T细胞活化，直接或间接诱导Th2细胞表达IL-4，并激活中性粒细胞黏附。IL-1α通过嗜中性粒细胞蛋白酶的加工可以使活性提高8～10倍[40]。IL-36家族细胞因子是多种炎症性疾病中的关键炎症介质。NETs结合的颗粒蛋白酶对细胞因子活性的控制能在PMNs募集过多的炎性环境中起作用。NETs还能促进巨噬细胞中IL-1β和IL-18的合成，进一步促进中性粒细胞中NETs的形成[41],从而导致了炎性环境的持续存在。IL-1β和IL-18均属于IL-1家族成员，能激活PMNs黏附。NETs可以阻止微生物传播和感染，也可以通过促炎细胞因子来加剧炎症。NETs上的蛋白酶可以通过破坏或激活细胞因子来调节细胞因子水平，从而削弱或促进炎症[42-44]。中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)是一种存储在中性粒细胞初级颗粒中的丝氨酸蛋白酶，可以促进中性粒细胞的组织浸润。NE通过蛋白水解过程调节细胞外细胞因子和趋化因子(包括IL-1家族细胞因子)的活性来作为促炎介质[45]。证据表明：中性粒细胞丝氨酸蛋白酶通过蛋白水解过程调节细胞外细胞因子和趋化因子(包括IL-1家族细胞因子)的活性来作为促炎介质[46]。

NETs在先天免疫系统中像一把双刃剑。NET的过量产生可能会导致慢性炎症，NETs也可以触发其他免疫细胞(例如单核细胞和巨噬细胞)通过NLRP3炎性小体释放IL-1β，这又导致了促炎环境的持续存在。推测RVVC的发病与中性粒细胞调节失衡有关，NETs虽具有抵御微生物的功效，但是一旦过量产生，势必导致局部免疫紊乱，阴道黏膜持续慢性炎症，不利于阴道微环境的修复。

2.6 RVVC发病与NLRP3炎性小体关系

NLRP3炎性小体是一种细胞内大分子结构，是炎性体复合物的关键组分,可识别危险信号并激活炎症反应，可通过释放IL-1β和IL-18来激活。NLRP3炎性小体的激活在VVC发病中有很重要作用[47,42]。NET通过LL-37激活P2X7R触发钾离子外流在激活巨噬细胞中的NLRP3炎性小体中起核心作用。NLRP3炎性小体通过激活caspase-1而启动炎症反应，活化的caspase-1可以将pro-IL-1β裂解为分泌型活性IL-1β，IL-1β是驱动宿主对感染作出反应的关键炎症介质。由NLRP3基因转导的IL-1β介导的过度炎症在RVVC的发病机制中起着重要作用，推测可能该通路是该病的潜在治疗靶点[48]。Roselletti等[42]通过检测20例VVC患者、15例被真菌定植但无症状患者、10例无真菌定植受试者中宿主阴道炎症因子和真菌毒力因子的表达。发现：负责编码NLRP3和caspase-1炎症体组分的基因的过度表达使VVC患者与无症状的定植或非真菌定植妇女显著分化。VVC妇女阴道NLRP3炎症小体的表达与中性粒细胞募集及IL-1β和IL-8的产生有关。这两种细胞因子都存在，尽管浓度较低，但在真菌定植和非真菌定植妇女的阴道液中也存在。表明NLRP3炎症体复合物胞浆内的激活在人类VVC发病中起着关键的作用[42]。

2.7 RVVC发病与MAPK/ SRF关系

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)存在于所有的真核细胞中，是胞内介导外界刺激信号通路之一。该信号通路是一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶系统，参与了细胞增殖、分化、运动、应激反应等活动，在细胞外信号转导与细胞反应中发挥着关键作用[40]。MAPK抑制剂U0126可阻断嗜中性弹性蛋白酶诱发的炎症，提示MAPK信号通路参与炎症反应[49]。MAPK通路特异性阻断剂(SP600125、PD98059和JNK、ERKβ激活抑制剂)可阻断中性粒细胞活化，抑制中性粒细胞活化导致的溶酶体释放和脱颗粒过程，表明MAPK通路参与中性粒细胞活化过程[50]。外源和内源刺激激活MAPK信号传导途径，诱导内皮细胞中的肌动蛋白重塑及内皮细胞通透性改变，使内皮细胞完整性被破坏以响应氧化应激反应。

血清反应因子(serum response factor,SRF)属于转录因子家族MADS(MCM1,agamous,deficiens和SRF)的成员之一，是普遍表达的转录因子和肌动蛋白细胞骨架的主要调节因子，其与靶基因的启动子区域中的血清反应元件(SRE)结合，通过三元复合因子(TCF)在丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)途径中发挥作用[51]。ERK、MAPK，通过向相邻蛋白质添加磷酸基团使信号级联传递，将转录因子[包括SRF，核因子κB(NF-kB)和环AMP反应元件结合蛋白(CREB)结合位点]激活并转移至细胞核，诱导靶基因表达[52]。SRF使中性粒细胞迁移至炎症部位；SRF对中性粒细胞的功能具有特异性, SRF可通过控制整合素聚集和运输促进活化的中性粒细胞黏附；SRF可通过影响中性粒细胞的结构和功能，导致中性粒细胞聚集和活化，说明SRF可能参与RVVC的发病。SRF是MAPK信号通路的下游靶标，甲基汞通过增强MAPK信号通路(p38和ERK)的磷酸化水平，使SRF依赖性基因CC基序趋化因子配体4(CCL4)的表达水平升高。MAPK(p38，ERK)抑制剂使CCL4的表达水平下降，提示MAPK信号通路的磷酸化可激活下游的SRF[53]。MAPK信号传导途径的激活，使内皮细胞完整性破坏以响应氧化应激，SRF通过控制整合素聚集和运输的过程，导致活化的中性粒细胞黏附和迁移至炎症部位释放NE，NE进一步促进中性粒细胞的组织过度浸润，导致炎症状态持续。VVC/RVVC可能是由中性粒细胞过度攻击性的先天性反应引起的，而不是适应性免疫反应受损[54]。因此，推测MAPK可能通过调控SRF从而导致中性粒细胞过度活化释放NE从而参与RVVC的发病。

综上所述，RVVC的免疫学发病机制复杂，到目前为止还未能有一种学说能够比较合理、全面地解释RVVC的发病过程。RVVC患者阴道内出现PMNs聚集，这有助于症状的发生，却不能清除念珠菌的感染，使阴道黏膜处于慢性炎症状态。说明RVVC患者可能存在局部黏膜免疫系统过度反应。RVVC患者阴道局部PMNs存在过度活化。MAPK信号通路激活，SRF通过控制整合素聚集和运输对PMNs的功能有特异性调控作用，导致活化的PMNs黏附、迁移至炎症部位、释放NE。NE进一步促进PMNs的组织过度浸润，建立正反馈机制循环，导致炎症状态持续。因此，MAPK可能通过调控SRF从而导致PMNs过度活化释放NE 从而参与RVVC的发病。在免疫学、分子生物学等多学科的知识帮助下，对于RVVC的免疫学研究会取得更大的突破和进展，从而为RVVC的防治提供一定帮助。