人视网膜脱离后细胞及细胞器超微结构变化的观察

纪康康 路星 丁婕 胡闻 章梅 董凯

视网膜脱离(retinal detachment，RD)是指视网膜神经上皮层与色素上皮层的分离，是造成人类视力障碍的常见原因[1，2]。进行视网膜再附着手术是促进视力恢复的主要方法，随着外科技术的发展，手术促进视网膜再附着的成功率超过90%[3，4]，但由于RD后组织缺血、缺氧，造成感光细胞的死亡，因此，患者术后视力恢复情况不甚理想，尤其当RD涉及黄斑部位时[2，5]。

近年来关于实验性视网膜脱离的相关研究表明，实验性视网膜脱离后，感光细胞出现凋亡、坏死、坏死性凋亡的形态学改变[6-8]，其中以凋亡为主[9]。过去关于RD后细胞形态变化的研究大都建立在动物模型的基础之上，关于人类RD后视网膜细胞的形态学改变的研究比较少，且研究的重点往往不是RD后各类视网膜细胞的形态学变化，Nag等[10]总结了人类视网膜正常情况下的超微结构以及在衰老和各种病理状态下的微结构变化，发现衰老的视锥视杆细胞出现外节盘膜的无序排列，感光细胞核形状、大小不一，染色质密度不同，空位明显等改变，在外伤性视网膜损伤后，内核层、外核层出血，感光细胞坏死；Nork等[11]在一项关于人类RD后视锥细胞和视杆细胞的选择性丢失的研究中提到，RD后3 d视网膜色素上皮层缺失，圆锥体严重肿胀，伴有异位核和固缩核。其他关于RD的相关研究中，尚未有对于人类视网膜细胞超微结构的针对性介绍，因此我们对5例RD患者进行术中取材，分别取孔盖、原发孔后缘、术中造孔后缘的视网膜组织，制片后分别记为A(2人)、B(2人)、C(1人)组，制片后通过透射电子显微镜(transmissionelectron microscopy，TEM)简单观察和比较了各组视网膜细胞的形态学变化，现将结果报告如下。

资料与方法

一、取材来源

本研究实验严格遵守《赫尔辛基宣言》的基本原则，并通过中国科学技术大学附属第一医院伦理委员会的批准(批准号：2020-(N)H-086)。取材来自5例RD患者。患者A1为右眼RRD患者，周边网膜10点钟方向可见1.5 PD大小的马蹄形裂孔1个，上方隐约可见孔盖,如图 1A，手术过程中将粘附有玻璃体的孔盖剪下，制作标本。患者A2周边网膜9点钟方向可见1个2 PD大小的马蹄形裂孔，同样方法处理孔盖制作标本。患者B1为左眼RD患者，全视网膜呈360度青灰色隆起，如图 1B，术中可见颞上方有约2.5 PD大小的长条形裂孔，裂孔后缘视网膜卷曲，视网膜为避免该卷曲的边缘影响视网膜再附着，术中予以剪下，作为标本制作的材料，B2为右眼鼻上方周边视网膜3 PD大小椭圆形裂孔伴有裂孔后缘网膜卷曲，同样方法处理裂孔后缘制作标本。患者C为右眼RD患者，于颞上方约10点方向可见约2/3 PD大小类圆形裂孔1个，下方网膜青灰色隆起，裂孔下方约9点方向有视网膜下增殖线条，如图 1C，该线条会影响RD术后视网膜的再附着，为提高患者预后，术中于视网膜增殖线条旁造孔，造孔时剪下的视网膜作为标本制作的材料，所制作的标本为C组。

图1 3例RD患者的眼底检查图像 A：患者A1右眼眼底图像，颞侧10点方向可见1.5 PD大小马蹄形裂孔和1PD大小圆形裂孔(白箭)；B：患者B1左眼眼底图像，全网膜隆起；C：患者C右眼眼底图像，颞上方1点方向可见2/3 PD大小类圆形裂孔(白箭)，其下方可见视网膜下长增殖线条(黑箭)

二、标本制作

取下的组织用2.5%戊二醛电镜固定液固定12 h,使用磷酸缓冲盐水(PBS)清洗3次，每次15 min,1%四氧化锇固定2h,然后用浓度梯度的酒精脱水，使用环氧乙烷浸透、包埋，然后将包埋块切片，厚度为70 nm,最后使用铅和铀，对标本进行染色，使核酸和细胞膜着色后自然风干，在TEM(日产JEM-1400Flash透射电镜)下观察拍照[2，8，12]。

结 果

以染色质浓缩边聚，细胞皱缩，细胞间距增大为凋亡；以质膜不完整，破裂，核固缩溶解为坏死；以质膜不完整、破裂，核固缩溶解，染色质浓集，并伴有明显的自噬泡和空泡为坏死性凋亡[6，8，12]。通过TEM观察发现，由于细胞结构破坏，已经无法具体区分某些细胞属于哪一类视网膜细胞，只能描述细胞死亡后的形态学表现。

在A组标本中，我们找到大量凋亡的感光细胞，它们主要表现为染色质浓缩边聚，质膜皱缩，细胞体积缩小，细胞间空位明显，偶见空泡化的线粒体，如图 2a；能够发现一些典型的坏死性凋亡表现，完全找不到质膜的边界，细胞核形态不规则，核膜皱缩，染色质浓缩，密度极不均匀，核周围可见大量空泡，无法区分该细胞属于哪一类视网膜细胞,如图 2b；电镜视野下发现了内部结构丢失的空泡化线粒体以及膨胀的内质网，部分线粒体结构尚未发生明显改变,如图 2c、图 2d；未发现该组标本有典型的坏死表现。电镜视野中偶见形态规则，质膜完整，染色质密度较均一的细胞。

图2 A组标本电子显微镜图像 a：凋亡的感光细胞。细胞质浓集、边聚(黑箭)，质膜皱缩(白箭)，细胞间空位明显，可见线粒体嵴断裂，逐渐空泡化(黑星),标尺：2 μm；b：坏死性凋亡的细胞。找不到细胞边界，染色质浓集边聚(黑箭)，核膜皱缩(白箭)，细胞核周围分布大量的空泡和自噬泡(黑星)，标尺：1 μm；c：胞质中可见空泡(黑星)，有结构完整的线粒体，部分线粒体内部结构丢失及空泡化(黑箭)，标尺：1 μm；d：内质网膨胀(黑箭)，胞质中出现空泡(黑星)，标尺：1 μm

在B组标本中，出现典型的坏死细胞，质膜破裂，胞浆内容物释放，可见完全空壳化的视网膜细胞，胞质出现空泡，如图 3a；视锥细胞内节坏死，质膜破裂，空泡化现象明显，线粒体数量减少且结构肿胀，线粒体嵴断裂，内部结构丢失，部分线粒体发生破裂,见图 3b；可见少量视杆细胞，内节出现空泡化现象，外节盘膜破裂,见图 3c；外核层感光细胞皱缩，细胞核边界模糊，但染色质密度尚均一，胞质中出现空泡，符合坏死性凋亡的表现，还可发现趋于裂解的细胞核，见图 3d；在神经纤维层附近发现染色质浓集、边聚的凋亡细胞，但内质网的结构尚正常,见图 3e；电镜视野下可以找到一些结构完整，染色质密度均一，核仁清晰的感光细胞，见图 3f。

图3 B组标本电子显微镜图像 a：坏死的视网膜细胞。细胞完全空壳化(黑星)，相邻细胞质膜破裂(黑箭)，胞质中出现空泡(白星)，标尺：2 μm；b：视锥细胞内段。质膜破裂,发生坏死(黑箭)，胞质中出现空泡(黑星)，线粒体数量减少，肿胀、嵴断裂、空泡化，乃至破裂(白箭)，标尺：2 μm；c:视杆细胞。外节盘膜破裂(黑箭)，内节胞质中可见空泡(黑星)，标尺：2 μm；d：坏死及坏死性凋亡的感光细胞。坏死感光细胞的细胞核趋于分裂(黑星)，坏死性凋亡感光细胞质膜皱缩(黑箭)、核边界模糊(白箭)、胞质出现少量空泡，标尺：2 μm；e:凋亡的视网膜细胞。在神经纤维层(黑星)附近发现染色质浓集、边聚的视网膜细胞(白箭)，胞质中可见结构清晰的内质网(黑箭)，标尺：2 μm；f：感光细胞。质膜完整，染色质密度均匀，核形态规则，边界分明，核仁清晰，标尺：2 μm

在C组标本中，少数细胞出现典型的坏死表现，核形态不规则，染色质密度均匀，质膜完全消失，裸露的核周围出现大量的自噬泡和空泡，无法分辨细胞类型，见图 4a；偶见凋亡细胞，染色质浓集现象明显，胞质中可见空泡,见图 4a；未发现坏死性凋亡细胞；视锥细胞内节线粒体数量明显减少，尚存的线粒体出现肿胀、空泡化、嵴断裂等表现，内部仅见少量残余的线粒体嵴结构，内质网膨胀明显，胞质中可见空泡,见图 4b、图 4c；相比于凋亡、坏死和坏死性凋亡，单纯的自噬现象在本组标本中更加常见，可见极细胞染色质密度均一，核形态规则，质膜完整，但胞浆空泡多见,见图 4d；部分视野中未发现细胞结构，仅见大量自噬泡和空泡堆积,见图 4e。

图4 C组标本电子显微镜图像。a：坏死和凋亡的视网膜细胞。细胞膜完全破裂，找不到细胞边界，核形态不规则，染色质密度均匀(白星)，裸露的核周围出现大量空泡和自噬泡(黑星)；相邻的细胞染色质浓集现象明显(黑箭)，胞质中可见空泡，标尺：2 μm；b：视锥细胞内节。线粒体(黑箭)数量明显减少，内质网明显肿胀(白箭)，细胞质中出现空泡和自噬泡(黑星)，标尺：1 μm；c：视锥细胞内节。线粒体嵴断裂、肿胀、空泡化，可见残余的线粒体嵴(黑箭)，标尺：1 μm；d：极细胞。胞质中出现大量空泡，标尺：2 μm；e：自噬泡和空泡堆积，标尺：2 μm；f：感光细胞，标尺：2 μm

比较A、B、C 3组标本，发现A组标本中几乎没有正常细胞，凋亡现象更为典型，存在不同程度的坏死及坏死性凋亡；B组标本中可见少量正常细胞，以坏死现象更为典型，存在不同程度的凋亡及坏死性凋亡；C组标本发现大量正常细胞，各种死亡方式表现均不典型，而自噬现象更加典型。

讨 论

关于RD的研究通常是在动物模型中进行，包括猫、大鼠以及一些灵长类动物等[2, 8, 13-16]，RD后感光细胞表现为凋亡、坏死、坏死性凋亡以及自噬的形态学变化。一项关于猫RD的研究发现RD后光感受器细胞外节、内节以及胞体都发生不同程度的死亡，视杆细胞死亡的速度快于视锥细胞，且RD时间越久，细胞死亡的表现就越明显，但在RD后3个月，细胞死亡的速度开始减缓[13]。受到以上研究成果的启发，我们进行了人类RD后视网膜细胞形态变化的研究，并从细胞距离原发病灶的距离这一角度出发，对比不同部位视网膜细胞死亡的程度，以了解细胞死亡程度是否与细胞距离原发病灶的距离有关。同时，本研究也首次在人体视网膜脱离组织中发现了光感受器细胞的坏死性凋亡。

实验结果表明，RD后，视网膜细胞出现凋亡及坏死性的表现，以孔盖处最为多见，坏死性凋亡表现为坏死和凋亡的共同特征，伴有明显的空泡化表现；细胞坏死以裂孔后缘最为典型；研究发现，在损伤早期，视网膜细胞自噬具有保护作用[17]，本实验发现造孔标本中，自噬现象更为多见，因此我们推测，在距离原发孔距离越远的地方，细胞死亡的程度越轻，由远及近，出现以自噬、凋亡、坏死为主要形态的变化。考虑到视网膜脱离是一个连续性过程，造孔处视网膜与裂孔周围视网膜的脱离时间可能存在较大差异，因此时间因素的影响也不能排除，由于无法在人体中根据视网膜裂孔等距离连续取材，也无法动态观察人视网膜脱离范围的变化，因此这一推测可能需要进一步动物实验去验证。受样本量限制，RD后距离原发孔不同距离的视网膜细胞的主要死亡方式是否存在差异，这一点还有待深入研究。