化学萃取同种异体肌腱重建兔跟腱缺损的研究

陈国飞，薛小华，蔡繁繁，陈侯磬，罗鹏，江长青，郭伟明

（1.华中科技大学协和深圳医院 运动医学科，广东 深圳 518052；2.中国科学院大学深圳医院创伤骨关节科，广东 深圳 518000）

跟腱损伤是常见的运动损伤，常因外伤引起。跟腱缺损常见于二次损伤或跟腱感染，需要外科手术治疗[1]。跟腱缺损常用的外科手术方式为V-Y翻转或肌腱移植。V-Y翻转成形术损伤大[2]，肌腱移植可选用自体肌腱及异体肌腱，自体肌腱需二次创伤，应用同种异体肌腱移植修复陈旧性跟腱断裂，根据缺损长短可提前制作供材，不仅减少了自体肌腱取材时造成的二次损伤及其引起的相关并发症，并且简化了手术方法，缩短了手术时间[3]。本次研究化学萃取同种异体肌腱在跟腱缺损移植中应用的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器

成年雄性新西兰大白兔45只，体重2.5～3.0kg，由北京华富康有限公司提供。将动物分成四组，其中一组将15只兔处死后取出双侧肌腱进行化学萃取处理，再将处理后肌腱回植至剩余30只兔子跟腱缺损处，并将兔子分成三组，每组10只，分别于术后6周、12周、24周抽取外周血并处死后取出移植肌腱进行组织学及生物力学对比。

1.2 跟腱取材及化学萃取

取材：新西兰大白兔予7%水合氯醛于耳缘静脉注射麻醉，后腿备皮，剪开腿部皮肤，暴露肌肉组织以及肌腱，分离肌肉充分暴露肌腱，剪下肌腱，注意避免操作过程中夹取或牵拉肌腱。

萃取方法：⑴100mL灭菌蒸馏水中水平振荡6h，灭菌蒸馏水冲洗三遍；⑵4%Triton X-100约100 mL中水平振荡12 h，灭菌蒸馏水冲洗三遍；⑶灭菌蒸馏水100 mL中水平振荡6 h，灭菌蒸馏水冲洗三遍；⑷4%脱氧胆酸钠液约100 mL中水平振荡12 h，灭菌蒸馏水冲洗三遍；⑸灭菌蒸馏水100mL中水平振荡12h。

1.3 跟腱损伤模型建立

将剩余的30只兔子腹腔注射7%水合氯醛（0.5 mL/100 g）麻醉后，将兔子后腿消毒刮毛，切开跟腱外层皮肤4.0 cm，分层显露皮下组织，显露兔跟腱处，切除跟腱2.0 cm，制作跟腱缺损，再将已制备好的萃取同种异体肌腱移植至跟腱缺损处，缝合固定连接同种异体肌腱，冲洗伤口，缝合切口。术后将手术的后腿用管型石膏固定于屈曲40°位。

所有兔子术后均在实验动物中心按标准饲养，昼夜规律正常。术后动物无不明原因死亡、自残、伤口感染、跖底溃疡等现象。术后3周将石膏外固定去除，任其自由活动。在术后6周、12周、24周时，分别随机取6只移植组动物处死后取出移植肌腱用于观察实验结果。

1.4 实验观察指标

1.4.1 大体观察指标

观察兔手术后伤口愈合情况、术后肢体的活动度、行走步态，并在取标本时观察移植肌腱缝合处愈合情况及大体形态。

1.4.2 组织学检查

将标本取出后，将未移植的萃取后跟腱组织和移植后不同时期的体内异体跟腱，进行病理切片、HE染色，Masson及电镜观察不同时期和不同种类的跟腱及缝合口的组织学变化。

1.4.3 免疫源性检测

分别于术后6周、12周、24周抽取三组动物的外周血2 mL，然后在EDTA-K2抗凝管中放置混匀，在4℃的温度下冷藏保存备用，检测时间控制在2 h内。添加并混合8μL的抗体D4(CT-4)FITC和8μL的抗体CD8-α(CT-8)FITC。标记，将5μL的鸡血加入其中，在37℃孵育箱中进行1 h的避光孵育。对红细胞进行裂解。上机对CD4+、CD8+T淋巴细胞数进行检测。

1.4.4 生物力学检测

移植肌腱拉伸断裂强度检测中，肌腱两端用纱布包裹，然后将其固定在检测仪两端，检测时用生理盐水不断喷湿肌腱，防止风干对实验结果造成影响。将肌腱拉伸至完全断裂，拉伸速度为10 mm/min，在肌腱拉伸断裂检测过程中，用相应软件详细记录结果；在检测肌腱拉伸断裂延伸率过程中，延伸率计算方法为（拉伸断裂长度-初始长度）/初始长度×100%[4]。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 大体观察结果

兔跟腱在移植后2周内可见术侧无法行走，呈跛行状态，3周后拆除石膏并拆线，可触及皮下跟腱，有连续性。行走状态较前改善，但术侧活动幅度较对侧明显降低，肌力低于正常。4周后，仍步态异常，速度慢。皮下肌腱触及可推动，肌腱增粗增大，肌腹腱连续性存在。双后肢活动幅度仍较正常降低，肌力较前增强。8周时兔可正常行走，步态无明显异常，速度仍较正常组慢，可轻松地推动皮下跟腱，连续性好。24周后兔术侧跟腱连续性好，无活动障碍，肌力正常。

从大体形态上，3周拆除石膏后，跟腱连续性存在，6周时移植跟腱增生，未触及明显增粗，12周时可触及明显瘢痕硬组织，24周后形态接近正常组织，无明显硬化及增粗。

2.2 组织切片观察结果

6周时组织病理切片可见少许血管增生长入，肌腱组织结构排列紊乱，连续性存在；8周时肌腱组织排列较整齐，可有胶原纤维长入，伴有局部坏死区；24周后可见腱组织排列整齐，腱束内未见明显坏死组织。

2.3 生物力学检测

生物力学检测结果见表1。

表1 生物力学检测结果（±s）

表1 生物力学检测结果（±s）

组别 拉伸强度（M P a） 最大拉伸（m m） 断裂伸长率（%）6周 1 5 9.0 0±3 5.0 0 2.6 9±0.8 9 1 8.8 6±1.3 7 1 2周 1 6 8.0 0±3 1.0 0 2.8 0±0.5 0 2 0.3 2±1.2 8 2 4周 1 7 6.0 0±2 3.0 0 3.3 1±0.7 4 2 2.0 4±1.3 1 P值 0.0 0 2 0.0 0 0 0.0 0 0

2.4 HE染色对比

在400X显微镜下，从6周开始可见同种异体肌腱组织内有细胞组织长入，12周细胞核逐渐增多，24周内肌腱组织HE染色可见肌腱内布满细胞核（图1-3）。

图1-3 400×显微镜下6周见细胞组织长入;12周见细胞核逐渐增多；24周见布满细胞核

2.5 免疫源性检测

6周、12周和24周检测外周血CD+4、CD+8T淋巴细胞计数所占比例及CD+4/CD+8比值，任两组间差异均有统计学意义（P＜0.05，表2）。

表2 免疫源性检测结果（±s）

表2 免疫源性检测结果（±s）

组别 C D+4 C D+8 C D+4/C D+8 6周 3 5.0±7.0 1 3.2±1.2 2.4±0.2 1 2周 3 1.0±7.0 1 4.5±1.1 2.1±0.1 2 4周 2 6.0±7.0 1 6.3±1.5 1.5±0.3 P值 0.0 0 1 0.0 0 0 0.0 0 0

2.6 Masson染色观察

术后6周、12周、24周分别取肌腱标本，常规行Masson染色观察肌腱内纤维组织情况。通过观察可见，随着时间的延长，化学萃取肌腱内纤维组织增多，排列更有序紧凑（图4-6）。

图4-6 6周、12周、24周肌腱内显微组织情况

2.7 利用电镜扫描

观察6周、12周、24周化学萃取异体肌腱在电镜微观下的结构，通过电镜扫描可见纤维组织胶原纤维随时间推移增多（图7-9）。

图7-9 电子显微镜扫描(2 000×)见显微组织胶原纤维变化

3 讨论

跟腱损伤常见于运动损伤，目前的主要治疗方式为外科手术。对于伴有跟腱缺损的手术方式可选择肌腱移植[4-5]，肌腱来源包括自体肌腱及同种异体肌腱。自体肌腱虽无排斥反应[6]，但来源有限，难以满足临床需求，且取自体肌腱会增加患者创伤。而同种异体肌腱来源广泛，能够满足临床需求，但其应用面临免疫排斥反应的问题[7-8]，目前采用的同种异体肌腱均为处理后无抗原移植物。同种异体肌腱的选择需要肌腱纤维结构，具备破坏小、力学结构稳定特点。而采用化学萃取后同种异体肌腱既处理了抗原，又能够较好地保留肌腱的生物力学性能，是作为跟腱缺损后移植重建的较好选择。

肌腱的愈合可以分为炎症期、增殖期和重塑期。炎症期在受伤后不久发生，组织形成血肿，细胞通过这些血肿进行传递[9]。而异体移植的肌腱主要经历坏死、血管化、细胞增值、塑形阶段。在移植早期可见到化学萃取异体肌腱移植后出现纤维结构的溶解，很少有细胞长入，并且肌腱移植后会出现纤维瘢痕增生，随后进入细胞增殖期。而到了移植中期，这时肌腱会开始增粗，肌腱中的Ⅲ型胶原蛋白随后逐渐被Ⅰ型胶原蛋白替代，可见到移植细胞的长入，通过HE染色以及电子纤维镜下可见移植肌腱上有较多的细胞长入，使其更为牢固。大约12周后，成熟阶段开始，主要是胶原纤维的不断交联和形成腱组织实质[10]。在本实验中的第12周肌腱明显增粗，而随着时间的推移，肌腱的愈合会进入重塑期，重塑期又包括两个阶段：巩固期和成熟期[11]。重塑期肌腱会变得更有韧性和弹性，而且塑形后的肌腱变得柔软，接近正常的跟腱组织，力学性能也能更加接近原有的跟腱组织。后期HE染色观察可见化学萃取后肌腱内布满了细胞核。24周时，从电镜下观察细胞的长入是最多的。

根据研究表明，CD4+T、CD8+T两个淋巴细胞亚群参与机体免疫排斥反应主要是通过细胞免疫和体液免疫两个过程协同作用[12]。二者比值的变化常作为移植后排斥反应的指标[13]，化学萃取肌腱移植后不同时间的淋巴细胞转化率均有明显差异，在移植后6周时的转化率最大，第24周的转化率明显低于其他组，第12周的转化率明显低于第一组，说明随着移植后时间的推移，移植后的肌腱细胞免疫原性越来越低，随着自体细胞的长入替代，移植后的肌腱组织逐渐形成自体肌腱。

从力学结构上，最初化学萃取后的肌腱组织在弹性模量和最大负荷是最小的，随着移植后时间的推移，肌腱的弹性模量和最大负荷都在增加，24周后达到最大值，不同时间组之间具有统计学差异。而到12周以后，与24周的差异较小，说明随着时间推移，移植肌腱在细胞长入后力学性能逐渐稳定。

综上所述，化学萃取法同种异体肌腱既保留了原有的纤维机构和生物力学性能，又降低了免疫原性，可为临床提供良好的供材。