指纹图谱结合聚类分析法研究清热解毒口服液的质量

陈 柯，陈 敏，邹惠亮

湖州市食品药品检验研究院，湖州 313000

清热解毒口服液是用石膏、金银花、玄参、地黄、连翘、栀子、甜地丁、黄芩、龙胆、板蓝根、知母和麦冬制成的中药制剂，为清热剂，具有清热解毒、养阴生津和凉血散结之功效，主要用于热毒壅盛所致的发热面赤、烦躁口渴、咽喉肿痛及流感、上呼吸道感染见上述证候者[1]。

方中重用石膏和知母，意在清热生津。黄芩、栀子和龙胆共用，意在清泻三焦火热。玄参、麦冬配生地为臣以养阴清热。佐以金银花、连翘、板蓝根和甜地丁退热解毒以透邪热。各药合用，抑菌抗病毒之功效尤强，并能凉血以消肿痛[2]。

根据国家食品药品监督管理局网站数据库检索的数据，截止2020年11月全国范围内清热解毒口服液的生产企业共198家、批准文号215个。受新型冠状病毒肺炎影响，在全国198家生产企业中有80家、91个批准文号为2020年批准，清热解毒口服液有较好的市场前景。

清热解毒口服液目前所用的质量控制标准为《中国药典》2020年版一部，鉴别项下主要为5个薄层色谱，主要控制绿原酸、栀子苷、连翘苷、菝葜皂苷元与麦冬质量，含量测定检测黄芩苷并不能全面地评价其质量[3-4]。清热解毒口服液生产单位众多，全国均有分布，各企业用的原料产地有巨大差异。本文建立指纹图谱方法，结合聚类分析与主成分分析法，可体现各企业的原料差异性，主成分的缺失可能是某些企业未合规投料所致[5]，该方法能对清热解毒口服液质量进行较全面地评价。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC20AD二元高压高效液相色谱仪(岛津公司)；XS205DU电子天平(梅特勒)。

1.2 试药

对照品：绿原酸(批号110753-201817，质量分数为96.8%)，芒果苷(批号111607-201503，质量分数为98.4%)，龙胆苦碱(批号110770-201716，质量分数为97.6%)，黄芩苷(批号110715-201821，质量分数为95.4%)，哈巴俄苷(批号111730-201709，质量分数为95.9%)，连翘苷(批号110821-201615，质量分数为94.9%)，均购自中国食品药品检定研究院。

试剂：乙腈、甲醇(色谱纯，美国默克公司)；乙醇、甲酸(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；纯化水(实验室制备)。

药材：石膏(批号1906003)，金银花(批号：1907613，1909036，200229)，连翘(批号：19006067，1910024，200424)，黄芩(批号：1904023，1911016，200318)，知母(批号：1811074，1901030，1911006)，栀子(批号：19003018，1906008，200104)，玄参(批号：1903112)，地黄(批号1001019)，甜地丁(批号1902052)，龙胆(批号1903084)，板蓝根(批号2002011)，麦冬(批号1904663)，均由浙江联康医药有限公司提供。

制剂：收集浙江市场的清热解毒口服液50批，涉及全国24家生产企业、24个批准文号，其中北京1批、河北6批、河南17批、湖北6批、吉林2批、江西4批、四川11批、重庆1批、浙江2批，见表1。

表1 50批清热解毒口服液样品信息

表1(续) 50批清热解毒口服液样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，以乙腈(A)-1 mL·L-1甲酸溶液(B)体系进行梯度洗脱，洗脱程序为0～12 min，10%～12%A；12～20 min，18%A；20～38 min，18%～36%A；38～42 min，36%～80%A；42～50 min，80%A。检测波长为278 nm。流速为1.0 mL·min-1。柱温为35 ℃[6-13]。

2.2 溶液制备

2.2.1对照品溶液制备 取对照品，用体积分数70%乙醇配制成约0.20 mg·mL-1的溶液，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液作为对照品溶液。

2.2.2样品制备 按《中国药典》2020年版一部清热解毒口服液项下制法，取1.2项下药材，随机组合不同批次药材，按以下方法制备样品15批，除石膏外，其余11味药均制备了缺单味药材的阴性对照样品。

制备方法：按10%处方量取12味饮片，除金银花、黄芩外，其余石膏等10味药加温水温浸1 h，煎煮(待煮沸后，再加入金银花和黄芩)2次，第1次1 h，第2次40 min，滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度约为1.17(80 ℃)，加入乙醇使乙醇体积分数为65%～70%，冷藏48 h，滤过，滤液回收乙醇，加入活性炭5 g，加热30 min，滤过，滤液加水至100 mL，滤过，灌封，灭菌，即得[1]。

2.2.3供试品溶液制备 精密量取制剂1 mL，置于50 mL量瓶中，加体积分数70%乙醇适量，振摇，用体积分数70%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1精密度实验 取编号S1的实验室样品，按2.2.3项下制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，14个标记峰的保留时间RSD在0.02%～0.60%之间，峰面积的RSD在0.07%～0.40%之间。表明该方法精密度良好。

2.3.2重复性实验 取编号S1的实验室样品，按2.2.3项下制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件，每份连续进样3次，14个标记峰的保留时间RSD在0.06%～0.70%之间，峰面积的RSD在0.04%～0.30%之间。表明该方法重复性良好。

取编号S1的实验室样品，按2.1项下色谱条件，分别用岛津LC20AD、AgilentLC1260和Waters e2695 3台仪器进样，用Agilent Eclipse Plus-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，结果13个标记峰与参照物峰的相对保留时间RSD在0.02%～0.40%之间，相对峰面积RSD在0.05%～0.80%之间。表明该方法仪器间重复性良好。

2.3.3稳定性实验 取编号S1的样品，按2.2.3项下制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，分别在0、2、4、8、16、24、48、72 h检测，14个标记峰的保留时间RSD在0.06%～0.90%之间，峰面积的RSD在0.10%～1.20%之间。溶液在48 h内稳定。

2.3.4耐用性实验 色谱柱考察：取编号S1的样品，按2.1项下色谱条件，用Agilent Eclipse Plus-C18、WelchUltimatePlus-C18、Cosmosil 5C18-MS-II 3根色谱柱对方法进行考察。

除保留时间有差异外，不同色谱柱色谱峰重复性良好。3根色谱柱的13个标记峰与参照物峰的相对保留时间RSD在0.06%～1.10%之间，相对峰面积RSD在0.50%～1.20%之间。

2.4 指纹图谱的建立与评价

2.4.1指纹图谱的构建 取编号为S1的样品与11批缺单味药的阴性对照样品，按2.1项下色谱条件进行分析。结果显示，样品色谱图能反映黄芩等8味药的特征。取2.2.1项下对照品溶液进行色谱、光谱分析，该色谱图能较好地反映6个对照品溶液对应的色谱峰，见图1。

图1 样品、缺单味药的阴性对照样品与对照品溶液各峰的定位

2.4.2特征峰归属 取编号为Z1～Z50的制剂，按2.1项下色谱条件分析，取具有代表性样品色谱图与样品色谱图进行分析，选择14个在上述色谱图中均出现的、峰高均大于最大峰峰高的5%的色谱峰为标记峰。标记峰归属为：峰1、2、9为金银花，峰3为知母，峰4为龙胆，峰5、6为连翘，峰 7、10、11、12、14为黄芩，峰8为板蓝根、峰13为玄参。

取编号为S1～S15的样品，按2.1项下色谱条件分析，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)，用平均数法、时间窗口0.1、14个标记峰，导入15批样品色谱图和2批代表性样品色谱图，生成对照图谱，见图2。

注：1.绿原酸；3.芒果苷；4.龙胆苦碱；10.黄芩苷；13.哈巴俄苷。

2.4.3相似度评价 以黄芩苷为参照物，供试品指纹图谱中应呈现与参照物色谱峰保留时间一致的色谱峰，并应出现14个标记峰，以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(S)、11、12、13、14号峰为标记。用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，以标记峰计算，与对照指纹图谱相比较，相似度不得低于0.90。

将50批制剂色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，进行相似度评价，50批制剂中含14个标记峰样品共27批，其相似度均大于0.90，其他23批存在标记峰缺失情况，无法进行相似度评价，50批制剂评价结果见表2。

表2 50批清热解毒口服液相似度评价结果

表2(续) 50批清热解毒口服液相似度评价结果

2.5 聚类分析

将50批制剂色谱图导入SPSS26.0和SIMCA14.1软件，用组间连接法，以余弦距离法作为样品间距离计算方法进行系统聚类分析[14]。结果见图3。

图3 50批清热解毒口服液的聚类分析

当判断距离为11时，所有样品被分为6类，地域区分较为明显，江西、湖北和河南一部分为1类，湖北同德堂和北京同仁堂各为1类，四川一部分、河南一部分和重庆为1类，黑龙江、河北、吉林和浙江为1类，四川一部分、河南一部分和浙江为1类，其采用的原料分布大致可分为6类，与指纹图谱评价结果一致；当判断距离为2时，所有相同厂家生产的被归为一类，符合实际情况。

2.6 主成分分析

用SPSS26.0和SIMCA14.1软件对峰面积进行标准化处理后，对50批制剂指纹图谱所得14个共有峰和峰面积较大的24个非共有峰进行主成分分析，计算相关矩阵的特征值及方差贡献率，见表3、表4。前4个因子的累积方差贡献率为90.056%，特征值均大于1，可代表14个共有峰及24个非共有峰的大部分信息。

表3 主成分特征值及方差贡献率

表4 主成分载荷矩阵

对上述主成分载荷值进行计算，得出各主成分的线性模型，成分综合得分Y=0.204X1+1.221X2+0.39X3+1.205X4+0.733X5+0.955X6+1.172X7+1.158X8+0.666X9+0.152X10+1.077X11+1.409X12+0.511X13+0.401X14+0.507X15+1.363X16+0.772X17+1.200X18+1.088X19+0.418X20+0.903X21+0.335X22+1.015X23+0.888X24+0.483X25+0.679X26+0.600X27+0.950X28+0.924X29+0.692X30+1.155X31+1.214X32+1.031X33+1.027X34+1.111X35+1.099X36+0.739X37+1.267X38,Y表示结合4个主成分得到的综合得分，X1～X38分别表示14个标记峰与24个非标记峰峰面积的标准化数据，综合得分越高说明质量越好。综合得分见表5。序号28之后得分均为负值，与指纹图谱结果相符合。

表5 50批清热解毒口服液成分的综合得分

3 讨论

3.1 不同生产企业产品价格与指纹图谱结果的相关性

收集的50批制剂均为口服液或合剂，制剂规格均为每支(瓶)装10 mL，其单价见表2，可发现一个比较有规律的现象。按本文所载方法相似度大于0.90的27批制剂平均单价为2.4元·支-1，其他23批平均单价为1.0元·支-1，两者相差较大，是否预示着按本文所载方法检测不符合要求的制剂的投料有不合规现象存在，有待后续进一步调查。

3.2 投料合规性与指纹图谱及聚类分析结果的相关性

结合产品处方，探索了指纹图谱的检测条件，按本文所载方法，清热解毒口服液指纹图谱应有14个共有峰，收集的50批制剂中有23批标记峰缺失，其他27批制剂均具有14个标记峰，且相似度均大于0.90。同一生产企业的指纹图谱基本一致，聚类分析在判别距离为2时也均归为一类，证明在相同企业中采用的原料基本稳定，其工艺也相对稳定。

在23批有标记峰缺失的制剂中，四川某制药和河南某药业的黄芩药材对应的峰有缺失，仅有黄芩苷主峰存在，而标准含量测定仅考察黄芩苷含量，可能存在直接用黄芩苷或黄芩提取物投料行为，投料不合规，建议在标准中增加黄芩的TLC鉴别，考察是否用饮片投料。连翘对应峰缺失，可能采用的连翘种类不同[15]。

河南某药业和武汉某药业知母药材对应峰缺失，可能其工艺有待改进，知母中皂苷类成分易损失，建议增加知母皂苷的含量测定[16-17]。

3.3 方法的优化

该方法中能体现栀子中所含色谱峰，但峰高小于最大峰峰高的5%，在个别批次实验室样品中不能很好的体现，综合考虑，不作为标记峰，因此在对照图谱中，能体现黄芩、金银花、玄参、连翘、龙胆、板蓝根、知母7味药材特征峰。本文方法无法体现地黄、麦冬、栀子和甜地丁4味药材特性[18-21]，方法仍有缺陷，但能反映大部分药材的特性，结合TLC鉴别，能较好地反映产品质量。