白藜芦醇基于NF-κB p65通路对脑胶质瘤细胞的作用

晋 涛，陶胜忠，范鲁鼎，李卓伦

1.郑州颐和医院神经外科，郑州 450000；2.郑州大学第二附属医院神经外科，郑州 450000；3.河南中医药大学(河南省中医院)神经外科，郑州 450000；4.郑州大学第一附属医院神经外科，郑州 450000

脑胶质瘤(glioma)是发生于神经外胚层的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，是颅内常见肿瘤，恶性程度高，浸润性强，复发率高。白藜芦醇是从多种植物中分离出的一种酚类化合物，具有抗癌、抗炎和抗氧化应激等功效[1-3]。白藜芦醇可增强脑胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性，抑制肿瘤生长[4]。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞在某些刺激因子作用下获得间质细胞表型的一种现象，广泛存在于胚胎发育、肿瘤转移及组织纤维化过程中。本研究以脑胶质瘤细胞U251为研究对象，探讨白藜芦醇是否通过核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路介导EMT过程，促进脑胶质瘤细胞的增殖和浸润，为临床治疗脑胶质瘤提供新的治疗靶点。

1 仪器与材料

1.1 仪器

多功能酶标仪购自美国BioTek公司；培养箱购自美国Thermo公司；高速冷冻离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；双垂直电泳仪购自北京六一仪器厂。

1.2 试药

白藜芦醇(质量分数>98%)购自美国Sigma公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)购自美国Sigma公司；细胞培养基购自美国Gibco公司；白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)和IL-1β、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α) ELISA试剂盒均购自美国Abclonal公司；上皮钙黏蛋白(epithelial cadherin，E-cad)、神经钙黏蛋白(neural cadherin，N-cad)、波形蛋白(vimentin)、NF-κB p65和p-p65抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

1.3 细胞系

人脑胶质瘤U251细胞株购自美国ATCC公司。

2 方法

2.1 细胞培养与分组

将脑胶质瘤细胞U251培养于含体积分数10%的胎牛血清、100 mg ·L-1链霉素和1×105u·L-1青霉素的DMEM培养基中，37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每2 天更换1次培养基，细胞达到80%融合时，胰蛋白酶消化传代，培养至第3代的U251细胞用于实验。

对数生长期U251细胞随机分为对照组、白藜芦醇组、激动剂组和激动剂+白藜芦醇组。DMEM培养基将细胞重悬，以每孔1×105个·孔-1的密度将细胞接种于96孔板，细胞贴壁生长后，对照组细胞不做处理，白藜芦醇组细胞加入白藜芦醇50 μmol· L-1处理12 h，激动剂组细胞加入LPS 1 μg·mL-1刺激12 h，激动剂+白藜芦醇组细胞先用LPS刺激12 h后，再加入白藜芦醇50 μmol·L-1处理12 h，进行实验。

2.2 MTT法检测细胞存活率

细胞培养24 h后，避光条件下每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液10 μL，置于培养箱中继续培养4 h，弃去原有培养基，每孔加入二甲基亚砜150 μL，37 ℃低速振荡10 min后，置于酶标仪上，设定波长为490 nm，测定吸光度(A值)。细胞存活率(%)=实验组A值/对照组A值×100%。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率

细胞培养24 h后，用DMEM培养基重悬细胞，以3 000 r·min-1离心10 min，离心半径8 cm，PBS清洗 2 次后，制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×105个·mL-1，先加入 Annexin V-FITC 5 μL充分混匀后再加入碘化丙啶5 μL，振荡混匀，室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.4 ELISA法检测IL-6、IL-1β和TNF-α表达

收集各组细胞上清液，根据说明书进行对照品稀释，取出酶标板设定空白孔、标准孔和待测样品孔，标准孔中加入稀释后的对照品50 μL，待测样品孔先加入样品稀释液40 μL，再加入待测上清液10 μL，37 ℃水浴锅中孵育30 min，洗涤液洗涤5次，拍干板子，除空白孔外，其余每孔加入酶标抗体50 μL，37 ℃水浴锅中孵育30 min，洗涤液洗涤5次，拍干板子，再加入显色液，37 ℃显色10 min，每孔加入终止液50 μL终止反应，酶标仪波长调至450 nm处，测量吸光度(A)值。

2.5 Transwell实验检测侵袭细胞数

Transwell小室的上室中铺上30 μg基质胶，DMEM培养基将细胞重悬，调整细胞密度为105个·mL-1，在Transwell小室的上室中加入细胞悬液200 μL，在Transwell小室的下室中加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基500 μL，置于培养箱中培养24 h，弃掉培养基，用棉签擦掉小室上室中的细胞，PBS清洗2次，用多聚甲醛固定15 min，用质量浓度为1 g·L-1结晶紫染色30 min，显微镜下观察并拍照。

2.6 蛋白印迹法检测细胞中蛋白相对表达量

收集细胞，PBS清洗2次，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，在4 ℃ 以12 000 r·min-1离心10 min，离心半径为10 cm，收集上清。BSA法测定蛋白质量浓度，依据标准曲线计算蛋白质量浓度。加入RIPA和蛋白上样缓冲液调整细胞密度，100 ℃煮沸10 min使蛋白变性。进行凝胶电泳，每孔加入蛋白样品20 μL，80 V电泳30 min，120 V电泳2 h，结束电泳。0.3 A湿转2 h，TBST洗膜5 min，3次，室温封闭1 h，E-cad、N-cad、vimentin、NF-κB p65、p-p65和GAPDH蛋白一抗(1∶1 000)于4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5 min，3次，二抗(1∶5 000)于低速摇床上室温孵育1 h，ECL发光液A液和B液1∶1配制，显色，Image J软件分析蛋白条带灰度值，目的蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值为目的蛋白条带相对表达量。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 细胞存活率检测结果

细胞存活率组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，白藜芦醇组细胞存活率降低(P<0.05)，激动剂组细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)；与白藜芦醇组比较，激动剂+白藜芦醇组细胞存活率升高(P<0.05)；与激动剂组比较，激动剂+白藜芦醇组细胞存活率降低(P<0.05)。见表1。

表1 细胞存活率比较

3.2 细胞凋亡率检测结果

细胞凋亡率组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，白藜芦醇组细胞凋亡率升高，激动剂组细胞凋亡率降低(P<0.05)；与白藜芦醇组比较，激动剂+白藜芦醇组细胞凋亡率降低(P<0.05)；与激动剂组比较，激动剂+白藜芦醇组细胞凋亡率升高(P<0.05)。见表2、图1。

表2 细胞凋亡率比较

注：A.对照组；B.白藜芦醇组；C.激动剂组；D.激动剂+白藜芦醇组。

3.3 ELISA检测结果

IL-6、IL-1β和TNF-α含量组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，白藜芦醇组IL-6、IL-1β和TNF-α含量降低，激动剂组IL-6、IL-1β和TNF-α含量升高(P<0.05)；与白藜芦醇组比较，激动剂+白藜芦醇组IL-6、IL-1β和TNF-α含量升高(P<0.05)；与激动剂组比较，激动剂+白藜芦醇组IL-6、IL-1β和TNF-α含量降低(P<0.05)。见表3。

表3 IL-6、IL-1β和TNF-α含量比较

3.4 Transwell实验检测结果

侵袭细胞数组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，白藜芦醇组侵袭细胞数减少，激动剂组侵袭细胞数增多(P<0.05)；与白藜芦醇组比较，激动剂+白藜芦醇组侵袭细胞数增多(P<0.05)；与激动剂组比较，激动剂+白藜芦醇组侵袭细胞数减少(P<0.05)。见表4、图2。

3.5 蛋白印迹法检测结果

E-cad、N-cad、vimentin和p-p65蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，白藜芦醇组E-cad蛋白相对表达量升高，N-cad、vimentin和p-p65蛋白相对表达量降低，激动剂组E-cad蛋白相对表达量降低，N-cad、vimentin和p-p65蛋白相对表达量升高(P<0.05)；与白藜芦醇组比较，激动剂+白藜芦醇组E-cad蛋白相对表达量降低，N-cad、vimentin和p-p65蛋白相对表达量升高(P<0.05)；与激动剂组比较，激动剂+白藜芦醇组E-cad蛋白相对表达量升高，N-cad、vimentin和p-p65蛋白相对表达量降低(P<0.05)。见表5、图3。

表4 侵袭细胞数比较

注： A.对照组；B.白藜芦醇组；C.激动剂组；D.激动剂+白藜芦醇组。

表5 E-cad、N-cad、vimentin和p-p65蛋白相对表达量比较

注：A.对照组；B.白藜芦醇组；C.激动剂组；D.激动剂+白藜芦醇组。

4 讨论

脑胶质细胞瘤常引起患者神经系统功能损伤，根据病理分级，可将脑胶质细胞瘤分为4级，Ⅰ级：癌细胞增殖能力低，手术治愈性高；Ⅱ级：癌细胞具有浸润性，有向高级别肿瘤进展的趋势；Ⅲ级：癌细胞具有恶性肿瘤特点，术后需进行辅助性放化疗；Ⅳ级：癌细胞具有恶性细胞学表象，生长快，进展快，复发率高，术后需要辅助性放化疗[5-6]。临床上常见的症状包括癫痫发作、颅内压升高、头痛、皮质脊髓束受累以及脑神经损伤等，但由于缺乏特异性常被误诊为急性脑血管疾病。目前，对于脑胶质细胞瘤的发病机制尚未明确。

中药由于其多靶点、毒副作用小、疗效佳等优点，在肿瘤的临床治疗上已受到广泛关注，例如三七皂苷可降低胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力，诱导癌细胞凋亡[7]，淫羊藿苷抑制非小细胞肺癌A549细胞存活和转移[8]。白藜芦醇又称芪三酚，存在于葡萄、虎杖和大麦草等多种植物中，ZHANG W等[9]研究发现白藜芦醇通过激活Nrf2通路发挥抗炎作用，减轻糖尿病大鼠神经病变的严重程度。HU Y等研究报道白藜芦醇可抑制缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡[10]。白藜芦醇作为一种药理活性广泛的传统中药，其在抗肿瘤方面的作用已被报道，白藜芦醇可增强肝癌细胞A549对辐射损伤的敏感性，提高肝癌的治疗效果[11]。XU Q H等[12]研究发现，白藜芦醇可通过逆转EMT过程抑制缺氧诱导的胃癌细胞迁移和侵袭，既往研究表明，白藜芦醇具有良好的抗肿瘤效用，但是其在脑胶质细胞瘤中是否具有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用仍待研究，因此本实验以脑胶质瘤细胞U251为研究对象，探讨白藜芦醇在脑胶质细胞瘤中的作用。实验结果显示，白藜芦醇可抑制U251细胞增殖和侵袭、促进其凋亡，同时可降低炎症因子释放。

EMT是一个复杂的生理过程，涉及多种基因，与肿瘤细胞的迁移和浸润密切相关。EMT发生过程中，原发灶癌上皮细胞失去上皮表型获得间质表型，细胞骨架重构、细胞形态及生物学行为发生改变、细胞之间或细胞基质间黏附性减弱，转变为具有迁移和侵袭能力的间质细胞，通过血液和淋巴循环转移到远处组织形成新的病灶。E-cad主要表达于上皮细胞，N-cad是间质细胞标志物，细胞骨架成分蛋白vimentin增高诱导EMT的发生，因此E-cad的减少和N-cad、vimentin的增加标志着EMT的发生[13]。NF-κB信号通路在细胞增殖、分化和凋亡过程中具有重要作用，而且与炎症反应密切相关[14]，正常情况下，NF-κB主要以p65和p50二聚体形式与IKB结合于胞浆，未见生物活性，当细胞受到外界刺激时，IKB发生磷酸化而被降解，暴露NF-κB二聚体从胞浆转移入细胞核，从而调控多种基因的转录，其中包括促炎细胞因子基因的表达。既往研究表明，NF-κB信号通路的激活与乳腺癌、非小细胞肺癌的增殖活性和迁移浸润密切相关[15-16]。LIU F F等[17]研究发现，阻断NF-κB信号通路可抑制喉癌细胞增殖迁移以及EMT过程。WANG Y S等[18]研究报道NF-κB信号通路参与调控EMT过程。黄芩素通过抑制NF-κB p65通路介导的EMT过程和炎症反应以改善肺纤维化，白细胞介素17A激活NF-κB信号通路介导EMT促进胆囊癌侵袭[19-20]。本实验以脑胶质瘤细胞U251为研究对象，探讨白藜芦醇抑制脑胶质细胞瘤增殖和侵袭是否与该信号通路有关。实验结果显示，LPS激活该信号通路后，E-cad蛋白表达减少，N-cad、vimentin蛋白表达增加，白藜芦醇预处理后，E-cad蛋白表达增加，N-cad、vimentin蛋白表达减少，此结果提示在脑胶质瘤细胞中，白藜芦醇可通过阻断NF-κB信号通路抑制EMT过程。

综上所述，白藜芦醇可抑制脑胶质瘤细胞增殖和侵袭，促进凋亡，其可能是通过调节NF-κB信号通路抑制EMT过程、减轻炎症反应发挥调控作用，为临床治疗脑胶质瘤提供理论依据。