地黄合剂介导p38 MAPK通路对糖尿病大鼠主动脉的影响

刘宝枚，王金玉，王明芳，庄乾君，陈照宇

日照市中医医院，日照 276800

2型糖尿病可以导致多种并发症的发生[1]，如微血管和大血管并发症、神经并发症等，其中微血管和大血管类疾病是导致2型糖尿病患者死亡的主要原因，高血糖症一旦发生，在主动脉就会发生氧化反应生成羰基[2]， 主动脉蛋白羰基的水平是评价蛋白质氧化水平最常用的方法，主动脉蛋白羰基的水平升高[3]，大量的活性氧会导致氧化还原反应失衡，激活敏感细胞的信号通路，如p38有丝分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK)，能够调节活性氧的产生[4]，形成一个前馈回路，从而导致内皮功能障碍、血管损伤或者炎症发生，同时也促使血管并发症的发生[5]。本研究主要探讨地黄合剂抑制p38 MAPK对糖尿病大鼠主动脉蛋白羰基和炎症因子的影响。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AG22331小型高速离心机 (德国Eppendorf公司)；AT-858自动酶标分析仪(美国热电Thermo公司)；DYY-8C电泳仪 (美国Bio-Rad公司)。

1.2 试药

氯沙坦[默沙东(杭州)制药有限公司] ；兔抗大鼠p38 MAPK多克隆抗(大连宝生物工程有限公司)；CREB兔单克隆抗体、MKK3/6兔抗人一抗、MKP1鼠单克隆抗体、COX2兔抗人一抗均购自北京中山生物技术有限公司；HE染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

2 方法

2.1 药液制备

地黄合剂主要成分引自《嵇书尧方》，处方：生地黄60 g(生地黄加黄酒10∶3的配比)，熟地黄60 g，炒白术60 g，淡干姜12 g，制川乌6 g，细辛4.5 g，蜈蚣3条，生甘草5 g。用水煎煮，第1次加入10倍的水量，煎煮30 min，第2次放入8倍的水量，煎煮30 min后过滤，合并滤液，浓缩成质量浓度为1 g·mL-1的灌胃液。

2.2 研究对象和模型分组

SPF健康大鼠，体质量为250～350 g，购自山东省鲁抗医药股份有限公司，动物生产许可证号为SCXK2013-0001。将50只SPF大鼠分为5组，正常组、糖尿病组、氯沙坦组、低剂量地黄(合剂)组、高剂量地黄(合剂)组，每组10只，禁食8 h，可饮水。

2.3 建模

5组大鼠正常喂养后体质量无明显差异，正常组大鼠用普通饲料喂养，糖尿病组、氯沙坦组、低和高剂量地黄组用高脂饲料进行喂养，喂养4周后，注射浓度为0.1 mol·L-1的链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液45 mg·kg-1到大鼠腹部，每次注射STZ 1周后随机测量大鼠血糖，血糖值大于16.7 mmo1·L-1为建模成功。正常组和糖尿病组每日给予生理盐水5 mL·kg-1， 氯沙坦组大鼠每日用氯沙坦0.4 g·kg-1灌胃，低剂量地黄组每日用0.25 g·kg-1地黄合剂灌胃，高剂量地黄组每日用0.5 g·kg-1地黄合剂灌胃，连续治疗4周，观察体质量和血糖的变化情况。所有大鼠最后一次灌胃后禁食12 h，给予20 g·L-1戊巴比妥钠(湖北鸿运隆生物科技有限公司)麻醉大鼠，静脉采血4 mL，腹部正中切开，取出腹部主动脉。

2.4 标本采集和处理

静脉血以2 000 r·min-1离心 20 min，取上清，置于冰箱里保存备用。血清中的炎性因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP-1)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)按照试剂盒说明书进行标准检测。取主动脉组织置于冰箱中保存，备用。

2.5 放免法检测心肌血管紧张素2的含量

取5组大鼠的主动脉组织各80 mg，分别置于1 mmo1·L-1的冰乙酸中匀浆，严格按照试剂盒说明书中的方法检测血管紧张素2的含量。

2.6 HE染色检测主动脉病理情况

取主动脉切片进行脱蜡，用苏木精液染色，染色时长为10 min，细胞核呈蓝色，胞质呈红色，再用蒸馏水去掉浮色，分色后，自来水清洗，进行复染，中性树胶封固，显微镜观察主动脉病理情况。

2.7 Western blot法检测p38 MAPK通路相关蛋白表达情况

将主动脉组织剪碎放入试管中，向其中加入1 mL PMSF细胞裂解液，裂解0.5 h，移到2 mL离心管中，以11 000 r·min-1离心10 min，取上清液置于离心管中，留存24 h后进行电泳和转膜处理， p38 MAPK、MKK3/6、MKP-1兔抗以1∶700的比例进行稀释，CREB1、COX2兔抗以1∶400的比例进行稀释，加入稀释后的p38 MAPK、CREB1、MKK3/6、MKP-1、COX2一抗在4 ℃下孵育，并倒入TBST洗涤3次，再加入二抗孵育， 二抗按照1∶10 000的比例进行稀释，用过氧化物酶进行标记，封闭120 min后倒入TBST，洗涤3次。采用ECL发光试剂盒对蛋白进行检测，将PVDF膜蛋白置于保鲜膜上，把 ECL的2种等体积试剂A和B置于PVDF膜上，使其充分混合，蛋白和发光液反应1 s，加一层保鲜膜，置于暗室中曝光，用Image J软件对图片的灰度值进行分析。

2.8 DNPH比色法检测蛋白羰基相关指标含量

采用DNPH比色法检测蛋白羰基的含量，收集细胞进行裂解，提取总蛋白，放在冰的生理盐水中漂洗，加入2，4-二硝基苯肼的的稀盐酸溶液2 mL，以1 500 r·min-1离心15 min，将获得的混合物去上清，将蛋白质悬浮于3 mL盐酸胍溶液中，用10 mmo1·L-1磷酸钾调pH值为2.5，定容，过滤，离心3 min，取上清液测定紫外吸收，读取270～370 nm处的吸光度值(A)， 后者与前者的比值即为蛋白质羰基的含量。SOD活性采用超氧化物歧化酶试剂盒进行测定，GSH-px采用谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒进行检测，MDA采用二醛试剂盒进行检测，GSH用还原型谷胱甘肽试剂盒进行检测，上述操作均按照试剂盒的使用说明严格操作。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠基本指标情况

未建模前，各组大鼠情况良好，建模成功后，大鼠出现食物摄入量增多现象，同时饮水量和尿量也相应增多，活动明显减少，体质量先降低，后期明显增加，建模第3周，多只大鼠出现口鼻碰撞出血，动作不敏捷，4周后，大鼠尾部出现发炎脱皮现象，糖尿病组中4只较为明显，氯沙坦组3只，低剂量地黄组6只，高剂量地黄组2只，实验结束后糖尿病组中有4只大鼠死亡，低剂量地黄组有2只大鼠死亡，氯沙坦组和高剂量地黄组各有1只大鼠死亡，共8只大鼠死亡。其中糖尿病组与正常组相比，体质量下降，血糖和血管紧张素2升高(P<0.05)；低剂量地黄组与糖尿病组相比，体质量和血管紧张素2的差异无统计学意义(P>0.05)，血糖明显降低(P<0.05)；氯沙坦组和高剂量地黄组与糖尿病组相比，体质量明显升高，血糖和血管紧张素2降低(P<0.05)，氯沙坦组和高剂量地黄组的体质量、血糖和血管紧张素2相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 大鼠基本指标情况对比分析

3.2 主动脉病理学变化情况

对建模4周后大鼠的主动脉进行HE染色分析，正常组血管内膜表面光滑，结构清晰，细胞的形态完整，没有脱落现象发生;糖尿病组血管内膜表面粗糙，出现水肿现象，细胞的形态不规则;低剂量地黄组、氯沙坦组、高剂量地黄组经药物治疗后，组织形态的变化均有不同程度的减轻，高剂量地黄组和氯沙坦组组织形态变化减轻程度最为明显(P<0.001)，低剂量地黄组次之(P<0.05)。见图1。

注：A.正常组;B.糖尿病组;C.氯沙坦组;D.低剂量地黄组;E.高剂量地黄组。

3.3 p38 MAPK通路相关蛋白表达情况

Western blot检测结果表明，正常组的p38 MAPK、CREB1、MKK3/6、COX2水平较糖尿病组的明显升高， MKP-1降低(P<0.05)，低剂量地黄组p38 MAPK、COX2与糖尿病组相比明显降低(P<0.05)，其他指标无明显变化。氯沙坦组与高剂量地黄组相比各项指标无明显变化(P>0.05)，氯沙坦组和高剂量地黄组的p38 MAPK、CREB1、MKK3/6、COX2水平与糖尿病组相比显著降低， MKP-1明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 p38 MAPK通路相关蛋白表达情况对比分析

注:A.正常组;B.糖尿病组;C.氯沙坦组;D.低剂量地黄组;E.高剂量地黄组。

3.4 蛋白羰基相关指标水平

通过对蛋白羰基、SOD、GSH、GSH-px、MDA对比分析发现，糖尿病组的蛋白羰基和MDA较正常组明显下降(P<0.05)，糖尿病组的SOD、GSH、GSH-px较正常组明显上升(P<0.05)；用药后，低剂量地黄组的蛋白羰基、SOD、GSH、GSH-px、MDA水平与糖尿病组比较差异无统计学意义(P>0.05)，氯沙坦组和高剂量地黄组的蛋白羰基、MDA较糖尿病组明显降低(P<0.05)，氯沙坦组和高剂量地黄组的SOD、GSH、GSH-px水平较糖尿病组显著升高(P<0.05)。见表3。

表3 蛋白羰基相关指标水平对比分析

3.5 炎性因子指标情况

实验结果表明，糖尿病组的炎性因子TNF-α、MCP-1、CRP、IL-10较正常组明显升高(P<0.05)；氯沙坦组的炎性因子TNF-α、MCP-1、CRP、IL-10与正常组相比差异无统计学意义(P<0.05)，与糖尿病组相比TNF-α、MCP-1、CRP、IL-10明显降低(P<0.001)；低剂量地黄合剂组的炎性因子TNF-α、MCP-1、IL-10与糖尿病组相比有所降低(P<0.05)，CRP无明显变化(P<0.05)；高剂量地黄合剂组的炎性因子TNF-α、MCP-1、IL-10与糖尿病组相比显著降低(P<0.001)。见表4。

表4 5组大鼠炎性因子对比分析

4 讨论

引起糖尿病的主要原因是胰岛素相对缺乏[6]，也可能是由于细胞组织对胰岛素的敏感性降低。糖尿病的主要特点是血糖升高，或者是体内的糖量代谢缓慢[7]，据调查统计，全球已经有4亿人罹患糖尿病[8]，未来20年内，糖尿病患者会暴增到6亿例，尤其是2型糖尿病患者的数量增长迅速[9]，目前已引起临床高度重视。流行病调查显示，我国糖尿病人口已达到1.4亿[10]，随着生活方式和饮食结构的不断改变，年轻人群的占比不断上升，目前年轻人已占糖尿病患者总数的12%，随着病程的延长，血管病变成为导致糖尿病患者死亡最主要的因素[11]。糖尿病涉及的病变范围比较广，随病程进展会导致血管内膜出现轻度的炎症，包括过度激活蛋白激酶糖基化产物增多、多元醇通路异常等。p38 MAPK信号转导通路在血管重构过程中发挥着纤维化和致炎的作用，所以要阻断p38 MAPK的转导，改变糖尿病的血管病变过程[12-13]。

与糖尿病大鼠相比，低剂量地黄组和高剂量地黄组大鼠的体质量明显升高，血糖和血管紧张素2降低，而且高剂量地黄合剂的药效相当于氯沙坦的药效，表明地黄合剂对改善大鼠的基本情况具有一定的作用。为了进一步验证不同剂量的地黄合剂在治疗糖尿病大鼠主动脉病变中的作用，采用HE染色进行验证，结果显示，随着地黄合剂剂量的逐渐增加，组织形态上都有不同程度的变化，其中高剂量地黄合剂对于大鼠主动脉病变的改善最为明显，低剂量次之。p38 MAPK是一种具有双重磷酸化能力的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞信息传递的交汇点，在调节细胞生长发育，调控炎症反应、应激作用以及多种生理过程中发挥作用[14-15]。本研究验证了不同剂量的地黄合剂对p38 MAPK通路相关蛋白表达情况的影响，结果显示，高剂量地黄合剂组大鼠与糖尿病组大鼠相比，p38 MAPK、CREB1、MKK3/6、COX2的表达水平显著降低，MKP-1的表达水平明显升高，表明不同剂量的地黄合剂会抑制p38 MAPK通路以及相关通路蛋白的表达。

蛋白羰基化是一个不可逆的化学反应，羰基化蛋白质从产生、聚集到被机体识别、分解有可能引起多种疾病[16]。蛋白质羰基化是一种氧化应激反应，其主要与机体内铁离子催化自由基的过程相关，进而导致蛋白质侧链上的氨基酸残基被损伤，蛋白质结构被破坏[17]。本研究通过对蛋白羰基、SOD、GSH、GSH-px、MDA进行对比分析发现，高剂量地黄组中的蛋白羰基、MDA与糖尿病组相比明显降低， SOD、GSH、GSH-px与糖尿病组相比显著升高，表明使用低剂量的地黄合剂，蛋白羰基相关指标与患病大鼠相比波动不明显，使用高剂量地黄合剂和氯沙坦，蛋白羰基相关指标与患病大鼠相比明显改善，氯沙坦和高剂量地黄合剂药效相当。有研究表明，地黄合剂能缓解糖尿病大鼠的蛋白排出，降低尿素氮，对糖尿病大鼠的肾脏具有保护作用[18]。相关研究发现，糖尿病大鼠主动脉病变是一个慢性低水平的炎症状态，炎症因子TNF-α、MCP-1、CRP、IL-10可参与糖尿病主动脉病变的发生和发展，同时还可损伤胰岛β细胞造成MS的恶化[19]。本研究发现，高剂量地黄合剂能明显降低炎症因子水平，表明高剂量地黄合剂与氯沙坦的疗效相当，优于低剂量的地黄合剂。曾有研究表明，地黄合剂能有效降低蛋白磷酸化水平，阻断p38 MAPK的表达，减轻糖尿病大鼠的炎症反应[20]。

综上所述，高剂量地黄合剂与氯沙坦的药效相当，能够有效阻断p38 MAPK信号通路，改善糖尿病大鼠主动脉的病理组织结构，降低主动脉蛋白羰基水平，抑制氧化还原反应发生，降低炎性因子水平。