PRPF3和CHEK1在肝细胞肝癌中的表达水平及临床意义*

梁 伟，李 娟△，罗中兴，杨晓刚

长沙市第三医院:1.检验科;2.血液肿瘤科，湖南长沙 410015

肝细胞肝癌(HCC)是常见的消化系统恶性肿瘤，每年死亡例数达35.81万人，死亡率达25.85/10万[1]。近年来随着外科手术、介入治疗等的发展，一定程度上提高了HCC患者的临床治疗疗效，延长生存时间，但仍有部分HCC患者首次诊断时已出现肝区疼痛、巩膜黄染、消瘦等中晚期症状，丧失最佳手术时机[2]。深入探究HCC的疾病发生机制，寻找能够预测预后的肿瘤标志物，具有重要意义[3]。前mRNA加工因子3 (PRPF3)编码基因位于1q21.2，编码蛋白功能是将细胞核中的mRNA前体中剪切去除内含子，形成由四个小核糖核蛋白和剪接因子组成构成的剪接复合体[4]。近年来发现，在皮肤鳞癌[5]、肝癌[6]等恶性肿瘤中表达显著升高，其能够通过激活JAK2/STAT3信号通路，促进肿瘤的恶性增殖及转移。检查点激酶1(CHEK1)基因位于11q24.2，编码蛋白属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族，当细胞DNA损伤或存在未完全复制DNA时，CHEK1参与调节细胞周期及DNA的损伤修复[7]。近年来发现，CHEK1在卵巢癌[8]、乳腺癌[9]等恶性肿瘤中表达水平上调，其作为一种促癌基因，促进肿瘤的恶性进展。本研究通过分析HCC中PRPF3、CHEK1的表达，探讨其临床预后价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集自2017年3月至2018年3月期间于本院诊治的86例HCC患者为研究对象。其中男50例，女36例，年龄31～78岁，平均(61.2±7.1)岁。纳入标准：(1)接受肝癌切除术，且经术后病理明确为HCC。(2)术前无放化疗、靶向治疗史及生物治疗等病史。(3)临床、病理及随访资料完整。(4)患者和家属对本研究知情同意。排除标准：(1)伴肝脓肿等感染性疾病。(2)伴其他器官恶性肿瘤。(3)合并严重的心肺脑等器官功能衰竭。(4)合并血液系统疾病。肿瘤大小：≤3 cm者54例，>3 cm者32例；肿瘤TNM分期：Ⅰ期55例，Ⅱ～Ⅲ期31例。病理分级：高中分化60例，低分化26例；甲胎蛋白(AFP)水平：<400 ng/mL 62例，≥400 ng/mL 24例；肝内转移：有23例，无63例。本研究经经本院伦理委员会批准并通过。

1.2方法

1.2.1癌症基因组图谱(TCGA)数据库中HCC组织及癌旁组织PRPF3和CHEK1 mRNA的表达水平 采用R 3.6.3对TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)中HCC数据的RNA-seq数据进行分析，同时应用R包：中的ggplot2[3.3.3版本]进行可视化处理，将FPKM 格式的RNAseq数据转换成了TPM 格式并进行log2转化。

1.2.2免疫组化检测 将HCC癌和癌旁组织(距离癌组织边缘2 cm以上)放入10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm切片后进行免疫组化染色。主要步骤：切片常规脱蜡，梯度乙醇水化，切片放入0.01 M柠檬酸缓冲液(pH6.0)中微波炉加热5 min进行抗原热修复，3%双氧水去除内源性过氧化物酶，一抗4 ℃过夜 (PRPF3稀释比1∶400，购自Abcam公司，货号ab272596；CHEK1稀释比1∶400，购自Abcam公司，货号ab40866)；滴加生物素标记的二抗室温孵育30 min；辣根过氧化物酶标记三抗室温孵育30 min，DAB显色30 s；苏木素复染细胞核5 min；梯度乙醇脱水，中性树脂封片。200倍显微镜下(日本OLYMBUS，BX53)观察阳性表达情况，染色评分根据染色强度(0：无染色，1：染色浅，2：染色深)和染色面积(0：≤25%，1：25%～50%，2：≥50%)的乘积评估。评分<2分为阴性表达，≥2分为阳性表达[10]。

1.2.3随访 随访自手术切除之日开始，随访终点为为患者死亡或随访时间结束。以门诊或电话的方式进行随访，每6个月随访一次，随访截止时间为2021年3月。

2 结 果

2.1TCGA数据库中肝细胞肝癌癌组织与正常肝组织中PRPF3和CHEK1 mRNA表达水平比较 TCGA数据库肝细胞肝癌癌组织中PRPF3 mRNA的表达水平显著高于正常肝组织，癌组织中CHEK1 mRNA的表达水平显著高于正常肝组织，差异具有统计学意义(P<0.001)。见图1。

注：与正常肝组织比较，***P<0.001。

2.2肝细胞肝癌与癌旁组织中PRPF3和CHEK1蛋白表达水平 癌组织中PRPF3阳性表达主要位于细胞质和细胞膜，CHEK1阳性表达主要位于细胞质和细胞膜，见图2。癌组织中PRPF3、CHEK1的阳性表达率分别为75.6%(65/86)、73.3%(63/86)，癌旁组织中PRPF3、CHEK1的阳性表达率分别为24.4%(21/86)、26.7%(23/86)，癌组织中PRPF3、CHEK1的阳性表达率明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=45.023、37.209，P<0.001)。

图2 免疫组化检测癌组织中PRPF3和CHEK1

2.3癌组织中PRPF3和CHEK1 mRNA及蛋白表达水平的相关性 利用R语言，采用Pearson相关分析肝细胞肝癌癌组织中PRPF3和CHEK1 mRNA表达水平的相关性，结果PRPF3和CHEK1 mRNA表达水平呈显著正相关(r=0.614,P<0.001)。采用Spearman秩相关分析肝细胞肝癌癌组织中PRPF3和CHEK1蛋白表达水平的相关性，结果两者蛋白表达水平亦呈显著正相关(r=0.601,P<0.001)。见图3。

图3 肝癌癌组织中PRPF3和CHEK1 mRNA

2.4PRPF3和CHEK1蛋白表达与临床病理特征间的关系 不同肿瘤TNM分期、病理分级及肝内转移癌组织中PRPF3、CHEK1的表达水平差异具有统计学意义(P<0.05)，不同患者的性别、年龄、肿瘤大小及AFP水平无关(P>0.05)。见表1。

表1 癌组织中PRPF3、CHEK1的表达水平与临床病理特征的关系[n(%)]

2.5癌组织中PRPF3和CHEK1表达对肝细胞肝癌患者生存预后的影响 86例患者随访2～36个月，平均生存时间为(26.1±4.2)个月，随访期间死亡49例，3年总体生存率43.0%(37/86)。PRPF3阳性表达组的3年总体生存率为33.8%(22/65)，平均生存时间为(22.1±4.0)月；PRPF3阴性表达组3年总体生存率为71.4%(15/21)，平均生存时间为(31.4±4.2)月；相比于PRPF3阴性表达组，PRPF3阳性表达组患者3年总体生存率较低，差异有统计学意义(χ2=6.214，P<0.001)，平均生存时间较短，差异有统计学意义(t=9.152，P<0.001)。

CHEK1阳性表达组的3年总体生存率为33.3%(21/63)，平均生存时间为(23.4±4.3)月；CHEK1阴性表达组3年总体生存率为69.6%(16/23)，平均生存时间为(30.7±4.6)月，相比于CHEK1阴性表达组，CHEK1阳性表达组患者3年总体生存率较低，差异有统计学意义(χ2=5.817，P<0.001)，平均生存时间较短，差异有统计学意义(t=6.840，P<0.001)。见图4。

2.6单因素及多因素COX比例风险模型分析影响肝细胞肝癌患者预后的危险因素 以患者生存状态为因变量(1=死亡，0=存活，t=生存时间)，以年龄、性别、肿瘤大小、病理分级、肿瘤TNM分期、肝内转移、AFP水平、PRPF3、CHEK1为自变量。单因素分析结果表明，肿瘤TNM分期Ⅱ～Ⅲ期、组织低分化、有肝内转移、PRPF3和CHEK1阳性表达是影响肝细胞肝癌患者预后的因素；多因素Cox回归分析结果肿瘤组织低分化、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期、有肝内转移、PRPF3和CHEK1阳性表达是HCC患者不良预后的独立危险因素。见表2。

表2 单因素及多因素COX比例风险模型分析影响HCC患者预后的危险因素

图4 PRPF3和CHEK1表达对患者生存预后影响

3 讨 论

肝癌是全球癌症相关死亡中第三大死因，具有发病率高，预后较差等特点。根据病理类型，肝癌分可为HCC，胆管细胞癌和混合型，HCC最为常见，约占所有类型的90%以上。目前，HCC的治疗包括手术切除、射频消融治疗及系统治疗等，能够延长患者的生存时间，但部分人群治疗后仍可发生肿瘤复发转移，导致患者死亡[11]。因此，需深入研究HCC的疾病发病规律，寻找新的HCC预后判断的肿瘤标志物，以指导临床治疗及随访。

mRNA前体剪接是转录过程中的基本过程，在蛋白质多样性形成方面发挥着重要作用。 mRNA前体剪接异常也是许多疾病，尤其是恶性肿瘤发生发展的病理学的关键[12]。PRPF3作为mRNA前体剪接的重要剪接因子，在核糖核蛋白复合体形成和募集到活性剪接体发挥重要作用[13]。近年来发现，恶性肿瘤中PRPF3在肿瘤中发挥促癌基因的作用，促进肿瘤的恶性进展[5]。本研究发现，HCC癌组织中PRPF3在mRNA及蛋白表达均较正常肝组织明显升高，与LIU等[6]报道结果一致。PRPF3表达升高的机制可能与转录调控有关。研究表明，肝癌中PRPF3的表达水平受孤儿核受体 HNF4α的表达水平调控，HNF4α能结合到PRPF3启动子区域，促进PRPF3的表达水平[14]。此外，肿瘤分期Ⅱ～Ⅲ期、低分化程度及伴肝内转移的HCC癌组织中PRPF3表达阳性率较高，提示PRPF3表达升高参与HCC的肿瘤进展。ZUO等[5]研究表明，PRPF3的表达上调通过激活JAK2/STAT3信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和转移，阻断JAK2/STAT3 通路后则能够逆转PRPF3诱导的促癌功能。此外，PRPF3的表达升高还能够通过促进肿瘤微环境中免疫抑制分子如PD-1等的表达，抑制肿瘤杀伤T淋巴细胞的肿瘤杀伤功能，导致肿瘤进展[6]。

DNA 损伤反应能够保护基因组完整性，可检测并发出DNA损伤信号以进行后续处理[15-16]。DNA损伤后细胞周期检查点的激活，促进直接 DNA 修复。当单链DNA损伤后，会激活共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶(ATR)，进而磷酸化激活CHEK1[15-16]。研究发现，CHEK1可以促进同源重组，稳定并重新启动停滞的复制叉，进而抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤的增殖[17]。本研究中，HCC癌组织中CHEK1的mRNA及蛋白表达水平明显高于癌旁组织，提示HCC中CHEK1表达水平上调。分析其原因，可能是CHEK1表达水平受到微小RNA的表达水平调控有关。研究发现，miR-508能够结合CHEK1mRNA的3′非编码区，抑制其表达，而肿瘤中miR-508表达水平下调，导致CHEK1 mRNA稳定性升高，促进CHEK1的表达[18]。此外，HCC癌组织中CHEK1的表达水平与肿瘤TNM分期、病理分级及肝内转移有关，表明CHEK1参与促进HCC的肿瘤进展。有研究报道，CHEK1的表达水平增加能够促进肿瘤细胞G2/M期的进行，进而导致肿瘤细胞过度增殖，促进肿瘤进展[8]。此外，尚有学者发现，肿瘤中CHEK1的表达能够促进肿瘤干性的形成，抑制肿瘤细胞对化疗药物的敏感度，导致肿瘤的复发转移[19]。

本研究进一步分析PRPF3和CHEK1与HCC患者生存预后关系，结果发现PRPF3阳性表达、CHEK1阳性表达的HCC患者生存预后较差，提示PRPF3和CHEK1是判断HCC患者生存预后的肿瘤标志物。单因素及多因素COX回归分析进一步证实，PRPF3阳性表达、CHEK1阳性表达是HCC患者不良预后的独立危险因素。因此，PRPF3和CHEK1是重要的HCC预后预测肿瘤标志物，检测有助于HCC癌组织中两者的表达情况有助于判断HCC患者的预后。本研究通过相关性分析发现，HCC癌组织中PRPF3和CHEK1的表达呈显著正相关，提示两者可能存在相互作用的关系。目前两者之间的具体作用关系尚不清楚，但有学者利用生物信息学分析发现，CHEK1是PRPF3的重要下游调节因子，两者在肝癌的发生发展中存在协同的关系[6]。因此，其具体作用机制有待深入探索。

综上所述，HCC中PRPF3、CHEK1表达水平上调，两者表达与肿瘤TNM分期、病理分级及肝内转移有关。PRPF3阳性、CHEK1阳性表达的HCC患者生存预后较差，是HCC患者不良生存预后的独立危险因素，可能成为新的HCC预后判断的肿瘤标志物。但本研究样本例数有限，有待扩大样本量进一步验证。