早期运动干预对糖尿病大鼠心肌结构和纤维化的影响

金山虎，艾 盼，彭亚力，扈 盛

（1.武汉体育学院 体育科技学院，湖北 武汉 430079；2.武汉体育学院 健康科学学院，湖北 武汉 430079；3.华中师范大学 体育学院，湖北 武汉 430079）

糖尿病是一种常见的慢性代谢障碍性疾病，全球糖尿病患病人数处在持续增长的阶段。IDF（International Diabetes Federation）最新数据显示，预计到2030年，全球糖尿病患者将会达到5.8亿［1］。糖尿病诱发的心脏结构和功能改变，是糖尿病的并发症之一。其主要表现为心肌纤维化、代谢失调以及心肌细胞肥大和凋亡。目前，研究认为糖尿病诱导的心肌结构和功能改变，独立于其他心脏危险因素发生［2］。运动干预已被证实是一种经济有效地治疗手段，可以通过影响心肌代谢，增强心肌抗氧化能力，从而减轻机体高糖环境诱导的心肌纤维化，同时改善心肌病理性重塑和心脏收缩舒张功能。但是，运动前干预对T2DM诱导的心肌纤维的影响还不确定。本实验，拟通过在高糖高脂膳食联合低剂量STZ构建T2DM大鼠模型的过程中增加中等强度的跑台运动干预，以探究中等强度的运动干预对T2DM诱导的心肌结构改变和心肌纤维化的预防作用，为制定预防糖尿病心肌损伤的运动处方提供理论依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

6周龄SPF级雄性SD大鼠30只，购自湖北省实验动物研究中心（许可证号：SCXK（鄂）2015-0018，No.42000600025097），体重180～220g之间，在武汉体育学院SPF级实验室进行饲养训练。环境温度和湿度分别为20～22℃、40%～70%，光照12h周期交替，自由进食、饮水。所有操作均严格遵守武汉体育学院道德伦理委员会要求。

1.2 实验分组

30只大鼠喂养1周适应环境后，随机分为NC组（对照组）、DM组（T2DM造模 组）、ME组（中等强度 运动组），每组10只。NC组标准啮齿类动物饲料喂养，DM、ME组均高糖高脂饲料喂养（基础饲料64.5%、蔗糖18%、猪油10%、蛋黄粉5%、胆固醇2%、胆酸钠0.5%），自由饮水进食；NC、DM组均笼中自由活动，ME组在高糖高脂饲料喂养期间进行中等强度的跑台运动。

1.3 实验造模

实验开始前，进行3d运动预适应；ME组跑台坡度为5°，速度为15m/min［3-4］。周1至周5训练，每次训练1h，持续训练8周。于第8周末，隔夜禁食不禁水12h，采用30mg/kg剂量，NC组腹腔注射浓度为0.1mmol/L的SSC（柠檬酸缓冲液），DM组和ME组腹腔注射2%STZ溶液。于注射后第7天尾静脉取血测大鼠随机血糖，以随机血糖≥16.7mmol/L为T2DM成模标准［5］。

1.4 主要仪器和试剂

ZS-PT大鼠跑台（北京众实迪创科技发展有限公司）；TGL18M离心机（凯达科学仪器有限公司）；STZ（美国Sigma生物技术公司，批号：WXBC6558V）；stepone plus型Real Time-PCR仪（美国ABI）。

1.5 组织取材及处理

STZ注射后第8天，尾静脉取血，测随机血糖；随后禁食12h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取心脏，在心尖、心底连接线中点横切心脏一份为二，心底端部分置于多聚甲醛固定液中，制作石蜡切片，后进行苏木精-伊红（HE）染色；心尖部置于-80℃，用于免疫组化和PCR（qRT-PCR）。

1.5.1 心室壁厚度

将HE染色切片进行电子扫描，用Image-Pro Plus6.0图像分析软件在电子扫描片上测量左心室前壁、侧壁、后壁和室间隔的厚度，取平均值为平均厚度［6］。

1.5.2 免疫组化测定α-SMA

首先切片脱蜡、透明剂处理、梯度乙醇至水、修复、冷却、冲洗、3%H2O2处理、冲洗、一抗、二抗孵育、冲洗、滴加50μL新鲜DAB、复染、分化、返蓝、脱水干燥、透明、封固；然后显微镜下观察α-SMA的表达及分布，用Image-Pro Plus6.0软件对图片进行分析，计算累计吸光度值。

1.5.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

先提取组织RNA，然后进行逆转录，准备miR-133a、U6PCR引物（见PCR引物表）。先用离心机离心再开盖，然后DEPC水稀释溶解，置于-20℃冰箱中备用。在50℃，2min；95℃，2min；95℃，10s和60℃，30s的反应条件下，以逆转录合成的cDNA为模板，循环40次完成PCR扩增反应。完成以后，通过调整基线及阈值。目的基因表达水平计算公式：目的基因相对量=2-△△Ct，△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因。miR-133a逆转录引物RT-mmu-miR-133a-3p，引物序列5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACG ACCAGCTG-3’；正向引物mmu-miR-133a-3p-FP，引物序列5’-CCCTTTGGTCCCCTTCAAC-3’；反向引物RP2，引物序列5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’。U6逆 转 录 引 物RTU6-2，引物序列5’-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3’；正向引物U6-2-F，引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’；反向引物U6-2-R，引物序列5’-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3’。

1.6 统计学分析

采用SPSS20.0进行统计学分析，计量资料以均值加减标准差（±SD）表示，组间比较采用单因素方差分析，当p＜0.05时为差异有显著性，当p＞0.05时为差异无显著性。

2 研究结果

2.1 各组大鼠随机血糖

与NC组 （4.88±0.61mmol/L）相 比，DM组 （22.60±5.48mmol/L）、ME组（16.26±6.23mmol/L）随 机 血 糖 都 有 显 著性增加（p＜0.05）；与DM组相比，ME组有显著性下降（p＜0.05）。

2.2 各组大鼠心肌HE染色和左心室室壁厚度

图1显示，NC组心肌细胞排列整齐，结构清晰，无明显病理改变；DM组心肌细胞排列疏松、紊乱，可见心肌断裂，细胞核明显增大，染色质凝聚、趋边。胞浆崩解，心肌细胞横纹溶解，可见明显空泡变性、脂肪空泡；ME组大部分心肌细胞排列整齐，未见心肌断裂，无明显空泡变性，胞浆染色较为均匀。

图1 各组大鼠心肌HE染色（400×）

测量左心室壁厚度，与NC组（2.17±0.47mm）相比，DM组（3.24±0.55mm）、ME组 （2.48±0.35mm）有显著性增加 （p＜0.05）；与DM组相比，ME组有显著性下降（p＜0.05）。

2.3 各组大鼠心肌α-SMA表达结果

图2显示，NC组α-SMA蛋白阳性表达较少，淡棕色染色阳性颗粒分布均匀、稀疏；DM组α-SMA蛋白阳性有较多表达，淡棕色染色阳性颗粒分布浓密；ME、组α-SMA蛋白阳性表达减少，淡棕色染色阳性颗粒较DM组明显稀疏。DM组（1 668.84±1 527.14）、ME组（565.32±560.89）α-SMA与NC组（325.41±372.77）相比，IOD值都有显著性增加（p＜0.05）；ME组α-SMA与DM组相比，IOD值有显著性下降（p＜0.05）。

图2 各组大鼠心肌α-SMA的表达

2.4 各组大鼠心肌miR-133a的表达结果

测量各组大鼠心肌组织中miR-133a的表达量，NC组（1.08±0.19）、DM组（1.21±0.37）、ME组（1.11±0.22）之间没有显著性差异。

3 分析与讨论

3.1 中等强度运动对随机血糖的影响

众多研究表明［7-8］，8周高糖高脂喂养配合低剂量STZ一次性腹腔注射构建T2DM大鼠模型的方法，稳定性好，可复制性强。本实验采用此方法构建T2DM模型，并在模型构建过程中加入中等强度的跑台运动，结果显示DM组随机血糖显著高于NC组，说明本实验T2DM大鼠模型构建成功。而ME组随机血糖显著低于DM组，提示在T2DM形成过程中加入运动干预，可有效预防随机血糖的增长。有研究证明［9-10］，运动可以调动更多的肌纤维，在消耗储存糖原的同时提高葡萄糖转运蛋白的含量，增加糖摄取能力进而改善血糖水平。本课题组其他研究也证实，在T2DM形成过程中加入中等强度运动，能有效干预空腹血糖、糖化血清蛋白的增长，从而有效预防或延迟T2DM的形成［11-12］。

3.2 中等强度运动对心肌结构的影响

糖尿病心肌损伤是糖尿病并发症之一，是导致糖尿病患者慢性心力衰竭及心源性死亡的重要原因。其可以导致心脏脂质沉积、心肌纤维化及心肌细胞死亡的增加等诸多心肌病理性改变，进而引起左心室的肥厚及收缩功能下降［13］。本实验心肌组织HE染色结果显示，DM组心肌细胞排列疏松、紊乱，可见心肌纤维断裂，细胞核增大，有炎性细胞浸润，脂肪空泡形成，这与储全根［14］等人在糖尿病心肌病的研究中的结果相同。左心室室壁厚度的增加是心肌肥厚及左心室重建的重要表现，本实验在心肌组织HE染色电子扫描片上测量左心室前、侧、后以及室间隔的厚度，取平均值为左心室厚度，发现DM组左心室室壁厚度较NC组有显著增加。杜常青［15］等人用心脏超声观察T2DM大鼠模型，出现了左心室室壁显著增厚，并同时伴有心功能降低、心肌细胞肥大的发生。Eguchi等人也证实了高血糖与左心室肥厚明显相关［16］。

运动作为一种干预手段，对于糖尿病及其引起的心肌损伤，都有很重要的防治作用。有学者发现，有氧运动能够增强心肌抗氧化能力，减轻心肌纤维化，抑制糖尿病诱导的病理性心肌重塑，改善心脏舒缩功能［17-18］。本研究在T2DM模型建立过程中加入运动干预，结果显示ME组相较于DM组心肌细胞排列趋于整齐，细胞间隙变小，空泡样变性减少。并且ME组的左心室室壁厚度较于DM组也有显著性下降，说明在T2DM形成过程中增加中等强度运动干预可以有效预防糖尿病引起的心肌结构改变。王世强［19］等人的研究表明，有氧运动可能通过增强心肌自噬能力，进而改善糖尿病大鼠心肌结构及功能。田阁［20］等人对高脂诱导的糖尿病小鼠进行8周的运动干预后，也出现了小鼠心肌血管纤维化比例显著降低，心肌细胞横截面积减小的现象。可见，有氧运动可以改善糖尿病诱导的心肌重塑。

3.3 不同强度运动对心肌α-SMA的影响

适量的运动可以降低血糖、提高胰岛素敏感性、抑制心肌纤维化、改善氧化应激，在糖尿病早期心肌纤维化的防治中发挥着重要作用［21］。糖尿病大鼠体内的高糖环境，促使心肌成纤维细胞（CFs）分化成特异性表达α-SMA的肌成纤维细胞（MFB）并分泌大量的细胞外基质是心肌纤维化的标志［22］。在肖明洋［23］等人的研究中，糖尿病对照组大鼠心肌纤维化情况较严重，心肌组织中α-SMA蛋白表达水平也较正常对照组显著升高。这与本实验的研究结果相似，说明T2DM引起了心肌纤维化。多项研究发现［21，24-25］，适量的运动可以通过降低血糖、抑制基质金属蛋白酶－2含量、改善机体能量代谢以降低心肌内糖原沉积等多种途径抑制心肌纤维化。刘雨佳［26］等人的研究还发现，有氧运动还可以通过增强机体抗氧化酶的表达，改善心肌纤维化。本实验在T2DM造模过程中加入中等强度的跑台运动，结果显示ME组心肌组织α-SMA的表达量比DM组有显著下降，说明在T2DM形成过程中加入运动干预，可以有效地预防糖尿病引起的心肌纤维化。但是，与NC组相比，DM组和ME组心肌组织α-SMA的表达量都有显著增加，说明运动干预虽然一定程度上降低心肌α-SMA的表达，有效减缓心肌纤维化，但在T2DM发展过程中，运动干预并不能完全阻断心肌纤维化的发生。

3.4 中等强度运动对心肌miR-133a的影响

miRNA作为内源性调节因子，可通过抑制翻译或裂解靶mRNA以调节转录后的基因表达。miR-133a作为心脏中表达最丰富的miRNA之一，有文献报道，其参与了糖尿病心肌纤维化的进程；可以通过靶向上调转录因子MEF2诱导心肌肥大；还通过影响心肌钾离子慢通道，一定程度上参与糖尿病心肌 损 伤 的 病 理 生 理 过 程［27-29］。Nandi［30］等 人 的 研 究 发 现miR-133a在STZ诱导的糖尿病小鼠心肌中过表达。但是本实验结果中正常组、糖尿病造模组、运动干预组心肌组织中的miR-133a的表达均无显著性差异。推测可能是本实验在造模结束后即刻，即处死大鼠取材，病理病程相对较短，仅仅引起了心肌室厚度的增加和α-SMA表达量的改变，并未引起基因水平上发生明显改变，提示心肌组织代偿能力较强。

4 结论

在8周高糖高脂膳食联合低剂量STZ构建T2DM大鼠模型过程中，中等强度有氧运动干预可以有效控制随机血糖的增长，降低左心室室壁的异常增厚，减缓心脏形态结构的病理改变，减少大鼠心肌组织中α-SMA的表达，减缓糖尿病诱发的心肌纤维化。但是在T2DM形成过程中并不能引起心肌miR-133a表达量的改变，提示心肌代偿能力较强。