贵州地区2017—2020年结核分枝杆菌卷曲霉素耐药与相关基因突变关系

李秋阳，曾强林，陈小菊，陈 玲

(1. 成都大学附属医院呼吸与危重症医学科，四川 成都 610081； 2. 遵义医科大学附属医院呼吸与危重症医学科结核病区，贵州 遵义 563000)

结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引起的慢性传染病[1]。由于各种因素，目前已产生耐药性TB。2020年世界卫生组织(WHO)TB年报[1-2]报道，耐药TB具有死亡率高、治疗方案不足和诊断易被延误的特点，患者数量有增多趋势。耐药TB的出现对全球TB控制提出了挑战[3]。

耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)指TB患者感染的M.tb体外被证实至少对异烟肼、利福平(rifampicin, RIF)耐药。卷曲霉素(capreomycin,CM)可应用于MDR-TB患者强化期治疗中[4]，但因M.tb对CM和其他已产生耐药的抗结核药物存在交叉耐药可能[5]，故使用CM抗结核前对TB患者进行耐药筛查尤为必要。

研究[6]结果表明，CM治疗MDR-TB效果显著。目前认为CM通过改变M.tb核糖体蛋白的功能抑制M.tb蛋白质的合成[7-8]。M.tb分离株对包括CM在内的抗结核药物的耐药性基本上是由特定基因靶点的自发点突变造成的[9-12]。多项研究表明，rpsL[13]、tlyA[8,14]、rrs[2、5]、eis[12]、Rv0194[12]及Rv1258C基因[15]为最主要的CM耐药相关基因，但它们的突变是否与CM耐药相关仍存在争议[16]。目前大多数研究仅针对单个CM耐药相关基因，缺乏对以上6个基因的同时分析，且多使用聚合酶链式反应(polymerase chain reacion, PCR)扩增相应基因，过程中难免会造成基因突变带来误差，从而影响实验结果。全基因组测序可避免上述问题，也有利于建立完整全基因组测序数据库，便于开展后续试验。此外，RIF作为一线抗结核药物代表，临床使用频繁，分析CM耐药与RIF耐药是否存在关联，有利于评估CM是否适用于利福平耐药结核病(rifampicin-resistant tuberculosis, RR-TB)患者抗结核治疗。

本研究拟对M.tb菌株做药物敏感试验(drug susceptibility test, DST)，并提取菌株DNA行全基因组测序(whole-genome sequencing，WGS)，检测上述6个CM耐药相关基因的突变情况，探究CM耐药基因型与表型的关系，以及CM耐药与RIF耐药的关联。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源M.tb标准菌株H37Rv，由贵州省疾病预防控制中心提供。

1.1.2 痰标本来源 收集2017—2020年遵义医科大学附属医院痰抗酸染色阳性的肺结核病患者痰标本。

1.1.3 主要试剂与仪器 十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB，中国天津市大茂化学试剂厂)、蛋白酶K(天根生化科技有限公司)、溶菌酶(Sanland-chem International Inc公司)、1 000 bp DNA ladder(康为世纪公司)、PCR Mix(结核分枝杆菌菌型分析试剂盒，北京康为世纪公司)、普通梯度PCR仪(美国Bio-Rad公司)、电泳仪(美国Bio-Rad公司)、凝胶成相系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1M.tb临床分离菌株的提取 取1～2 mL氢氧化钠预处理后的临床痰标本接种在2管酸性培养管斜面上，37℃恒温培养箱培养，按时间表观察生长情况，提取阳性培养管中菌株并鉴定菌型。

1.2.2 固体比例法检测M.tb临床分离菌株药物敏感性 对M.tb临床分离株进行抗结核一线和二线药的DST。(1)制备改良罗氏(L-J)培养基：KH2PO42.4 g、MgSO4·7H2O 0.24 g、柠檬酸镁0.6 g、谷氨酸钠7.2 g、丙三醇12 mL、蒸馏水600 mL。(2)制备含药培养基：L-J培养基中分别加入表1所示滤菌后的药剂至其对应含药终浓度。(3)菌液制备：在1支5 mL超声分散管和2支离心管中各加入2、1、1 mL的0.5%吐温-80生理盐水；挑取培养物放入超声分散管，超声分散20 s，后加入0.5%吐温-80生理盐水至浓度为1 mg/mL；吸取10 μL菌液(浓度1 mg/mL)加入离心管内，得到浓度为10-2mg/mL菌液，再取10 μL菌液(浓度为10-2mg/mL)加入到另1支离心管内，得到浓度为10-4mg/mL菌液。(4)接种及培养。每株菌株各取10-2、10-4mg/mL菌液10 μL接种在4个L-J培养基上，对照组、含药物试验组各2个，放入37℃培养箱1个月观察菌落生长情况。(5)根据菌落生长及耐药百分比判断药物敏感试验结果。

表1 含药培养基药物浓度

1.2.3M.tbDNA的提取与菌株鉴定 (1)取培养管内M.tb菌落置于加有400 μL 1×TE溶液的EP管中，80℃水浴箱水浴30 min后加入20 μL溶菌酶溶液(50 mg/mL)，37℃水浴箱中放置>2 h。CTAB法提取DNA作为PCR和WGS的DNA模板，-20℃冰箱保存。(2)针对人型结核分枝杆菌特异性序列设计引物mtb1(5’→3’：ATAGGGAATGCTCGGCAAC)和mtb2(5’→3’：CAACATCGACGCAGTACCC)，根据结核分枝杆菌复合群特异性序列IS6110设计引物IS6110-P1(5’→3’：TCAGGTCGAGTACGCCTTCT)和IS6110-P2(5’→3’：CGTCGCAGAGATCCGCGGTC)，使用M.tbPCR Mix扩增，产物分别为361、850 bp两条片段，可鉴定为人型M.tb。

上述试验步骤均在遵义医科大学附属医院呼吸医学实验室的微生物实验室及二级生物安全柜中进行，试验前后均消毒。

1.2.4 判断标准 多耐药、耐多药(multidrug-resistance, MDR)、泛耐药(extensively drug resis-tance, XDR)判断标准参照文献[1]。

1.2.5 WGS (1)DNA模板外送北京邦莱生物科技有限公司进行WGS，使用illumina二代测序平台，CTAB法提取的M.tb基因组DNA作为模板进行DNA片段文库构建，双侧测序(Paired-end Sequencing)，按照每样本200倍M.tb基因组的测序深度上机(约获得1 G数据/样本)，过滤掉接头(adapter)和索引(index)序列后得到约150 bp读长(reads)的序列。(2)数据质控：Trimmomatic软件过滤掉WGS原始Fastq文件中低质量reads；剩余所有reads与M.tb标准菌株H37Rv(GenBank AL123456)基因组比对，通过MTBseq流程(https://github.com/ngs-fzb/MTBseq_source)分析M.tb基因组数据覆盖中位数(coverage median)，coverage median≤30的数据排除分析。(3)提取单核苷酸多态性(SNP)序列：应用ubuntu(illumina)系统，Picard-tools、BWA、GenomeAnalysis、samtools等软件处理上一步骤获得的数据，提取试验菌株全基因组中的SNP序列。(4)检测突变点：SNP序列同标准菌株比对，检测CM耐药相关基因tlyA、rrs、rpsL、eis、Rv0194及Rv1258C序列内的突变位点。(5)突变类型：NCBI网站比对突变位点所在的读码框，明确突变类型。(6)确认新突变：BLAST比对检测到的基因突变与数据库已有数据，明确该突变是否已被发现。

1.3 统计学方法 应用SPSS 23.0软件对数据进行整理分析，采用卡方检验分析CM耐药与RIF表型耐药是否存在关联，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 菌株培养分离及DST结果 共培养123株M.tb临床分离菌株，其中，对抗结核一线和二线药全敏感68株，耐药55株。耐药菌株中，单耐利福平(rifampicin-reisistant，RR)2株，多耐药4株，MDR 49株，含6株XDR。123株菌株中，6株CM DST失败，CM敏感113株，CM耐药4株，且均为MDR(含1株XDR)，RIF耐药52株(2株RR、1株多耐药、49株MDR，MDR中含6株XDR)。CM耐药菌株DST结果见图1。

注：从左向右分别是10-2 mg/mL对照组、10-2 mg/mL含CM药物组，10-4 mg/mL对照组、10-4 mg/mL含CM药物组。

2.2 菌株CM耐药相关基因突变情况与对应耐药表型 WGS数据显示，所有菌株均检出tlyA基因A33G同义突变及Rv0194基因T221C非同义突变；Rv0194基因C3293T非同义突变在77株菌株中检出，CM耐药菌株中均检出；rpsL基因A128G非同义突变的菌株(16.3%，20/123)中CM耐药3株，CM敏感14株，其余CM的DST失败；rrs基因A1401G突变菌株(1.6%，2/123)均对CM耐药；rrs基因A908C、rpsL基因A263C、Rv1258C基因C1065T及Rv0194基因C1810T突变的菌株CM的DST失败；其余28种突变类型的菌株均对CM敏感。见表2。

表2 123株M.tb菌株突变位点、CM药敏信息及文献报道情况

续表2 (Table 2， Continued)

2.3 CM耐药菌株基因突变情况统计 2株CM耐药菌株rrs基因A1401G突变，3株CM耐药菌株rpsL基因A128G非同义突变，4株CM耐药菌株均检出Rv0194基因C3293T、T221C非同义突变及tlyA基因A33G同义突变。见表3。

表3 CM耐药菌株基因型和表型比对

2.4 CM与RIF表型耐药相关性分析 CM耐药菌株均为RIF耐药，CM与RIF表型耐药比较(采用Fisher确切概率法)，差异具有统计学意义(列联系数r=0.228，P=0.022)。见表4。

表4 CM与RIF耐药表型相关性分析(株)

3 讨论

贵州地区为我国TB高发地区，遵义医科大学附属医院为大型三甲综合医院，患者数量大，标本数量多。本研究对分离自该院的123株M.tb进行抗结核药物的DST，其中6株CM DST失败，CM敏感113株，CM耐药4株；RIF敏感71株，RIF耐药52株。WGS共检测到rrs基因6个突变，rpsL、Rv0194、eis、tlyA和Rv1258C基因的8个同义突变和23个非同义突变。13株菌(10.6%)检出rrs基因6个不同的突变位点，其中A1401G基因突变率为1.6%(2/123)，与既往研究[19]数据相符。其余5个CM耐药相关基因非同义突变情况如下：20株(16.3%)菌株rpsL基因A128G突变，6株(4.9%)A263G突变，tlyA基因C86T突变、eis基因G11A和T501G突变、rpsL基因A263C突变菌株各1株(0.81%)。rpsL基因整体突变情况与既往研究[13,18]一致。检出Rv1258C基因C55T、C322T、C633T和G1240A突变各1株(0.81%)，分布于4株不同的菌株中；所有菌株均检出Rv0194基因T221C突变，77株(62.6%)发生C3293T突变，4株(3.3%)发生A1384G突变，其余C292G、A571G、C633G、C661A、C752A、C1810T、C1985T、T2575C、A3133G和T3395A突变各1株(0.81%)。除上述报道过的基因突变，本研究首次发现eis基因非同义突变，Rv1258C基因C55T、C322T和C633T突变，Rv01946基因C292G、A3133G、T2575C、C661A、C1810T、T3395A、A571G、C752A、C1985T和C633G突变，以及rrs基因A1356G、C1236T、G5T突变。

CM耐药菌株中rrs基因A1401G、rpsL基因A128G、Rv0194基因C3293T和T221C突变。rrs基因A1401G突变仅在CM耐药菌株中检出，提示该突变类型可能与CM耐药存在联系，与多项研究[2，5，19]结果一致，且该突变位点可能也与卡那霉素、阿米卡星耐药相关，可作为潜在预测CM、卡那霉素、阿米卡星耐药的靶点[2，5]。所有CM耐药菌株和部分CM敏感菌株检出Rv0194基因C3293T，提示该突变可能与CM耐药相关，但还需明确该突变在CM敏感菌株发生后未导致耐药产生的机制。rpsL基因A128G突变虽然只在CM敏感菌株中检出，但Zhao等[13]研究支持该突变位点与CM耐药可能存在关联，并可能为二线氨基糖苷类耐药相关的交叉耐药靶点；Rv0194基因T221C突变在所有菌株中均检出，暂不考虑与CM耐药有关；tlyA基因A33G为同义突变，考虑与CM耐药无关；其他基因突变均在CM敏感菌株中检出，考虑为基因多态性，暂考虑与CM耐药无关联。综上所述，本研究推断CM耐药可能与rrs基因A1401G、rpsL基因A128G和Rv0194基因C3293T突变存在一定关联，以上基因突变可作为CM耐药监测靶点，但不能排除作为其他抗结核药物交叉耐药靶点的可能[20]，临床工作者在制定抗结核治疗方案时可作参考。此外，本研究还发现了若干未报道过的基因位点突变，但尚未发现这些突变与CM耐药相关，推测可能为基因多态性，需进一步验证。

RIF为一线抗结核药物，然而目前临床已出现大量RR-TB患者，CM与RIF耐药相关性分析有助于CM耐药筛查及RR-TB患者用药指导。本研究中M.tb临床分离菌株CM及RIF的DST结果统计分析表明，CM表型耐药与RIF表型耐药存在相关性，但关联程度一般，且本研究中CM耐药菌株仅4株，样本量偏少，不足以证实RR-TB患者对CM耐药，缺乏临床用药指导意义，后续还需加大样本量探究CM与RIF耐药相关性。CM耐药机制方面，本研究仅针对6个报道过的耐药相关基因进行研究，未深入了解这些基因作为其他一、二线抗结核药物交叉耐药靶点的可能，可在后续研究中进一步探讨。此外，还可从功能变异的替代形式，如大缺失和其他功能丧失突变导致CM耐药方面展开研究[21]。

本研究对123株M.tb临床分离菌株进行CM表型与基因型，以及CM和RIF DST的对比分析，证实菌株存在对CM和其他抗结核药物交叉耐药可能，临床工作者在制定抗结核治疗方案时可作参考。后续研究需进一步明确CM耐药机制，以及CM与其他抗结核药物是否存在交叉耐药。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。