血管分泌因子Rspondin3调控Wntβ-catenin信号通路促进急性肺损伤组织修复的机制研究

李 鹏， 欧阳运萍， 陈 涛， 赵 博, 杨小军

(河北省唐山市协和医院， 河北 唐山 063000)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI) 急性肺损伤是因多种的疾病导致的肺部的损伤，可能会导致呼吸窘迫综合症，还会出现多器官的功能的障碍综合症，也是一种比较常见的慢性的疾病[1]。根据1994年欧美联席会议提出的ALI诊断标准,在发达国家ARDS发病率分别在每年79/10万和59/10万，病因不同ALI发病率也不同[2]。Rspondin 3 (RSPO3; Cristin 1) 是一种分泌型Wnt调节蛋白，在发育中的心脏的顶板、中胚层、动脉干、房室管中表达，也在多种疾病的发生发展中发挥重要作用[3～5]，但是其在急性肺损伤中的作用机制尚不清晰。Wnt 信号通路参肺部发育、体内平衡、损伤后的再生、体外定向分化，但是在急性肺损伤中的作用尚不清晰[6,7]，但是Wnt-3a信号通路是否受到Rspondin 3调控在急性肺损伤中发挥保护作用尚不清晰。因此本研究拟通过建立大鼠急性肺损伤模型，探究Rspondin3对大鼠急性肺损伤的保护作用，及对wnt信号通路的调控机制，为临床Rspondin3在急性肺损伤中发挥的调控作用提供分子基础。

1 材料与方法

1.1实验动物

1.1.1SD大鼠:60 只8-10周龄雄性SPF级SD大鼠220g±20g，购于北京百奥赛图基因生物技术有限公司(SYXK(京)2020-0047)。大鼠饲养条件：温度(22±2)℃，相对湿度(50±5)% ，噪音60 分贝 以下 ，通风换气8 次/h。本实验通过医院伦理委员会审核。

1.1.2药品与试剂:戊巴比妥钠购自天津市申泰化学试剂有限公司；苏木精(H9627)、伊红(H9627)，大鼠 IL-1 ELISA 试剂盒(RAB0272)、大鼠 IL-2 ELISA 试剂盒(RAB0311)，大鼠 IL-6 ELISA 试剂盒RAB0246购于美国sigma公司；引物，Rspondin3质粒和NC质粒购于上海生工有限公司。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，反转录试剂盒购买于日本TAKARA有限公司。

1.1.3仪器设备:4℃及-80℃低温冰箱购自海尔股份有限公司，CGF-300A低速离心机，购自湖南湘锐有限公司，包埋机、切片机等购于德国莱卡有限公司，MDpectraMax190酶标仪购于美国赛默飞公司，western blot电泳仪购于美国BD公司。透射电镜JEM-1230 德国JEOL公司。

1.2实验方法

1.2.1大鼠分组及给药方式:大鼠自由摄取食物和饮用水，适应性饲养一周后，除对照组外，各组以 10mg/kg LPS腹腔注射诱导大鼠急性肺损伤模型。模后2h大鼠后逐渐出现高热，呼吸急促等表现即为造模成功。对照组给与等量生理盐水。造模后各组大鼠在造模后随机分为3组，模型组、NC组和Rspondin3组，尾静脉注射NC质粒和Rspondin3质粒，对照组和模型组给与等量生理盐水，1周后对各组大鼠进行相应指标检测。

1.2.2HE染色:采用脱颈法处死大鼠分离肺组织，置入 10%甲醛液中固定48h,持续流水冲洗1h，包埋后用石蜡切片机切4μm厚度切片，60℃烘箱5min；二甲苯Ⅰ 脱蜡20min，二甲苯Ⅱ 脱蜡10min，梯度乙醇各1min；苏木素染色5min，伊红染色1min；依次运用不用浓度的50%～70%～80%乙醇脱水1min，再用95%乙醇漂色1min，无水乙醇脱水5min，最后放入二甲苯Ⅰ3min，二甲苯Ⅱ3min；中性树胶封片后显微镜下进行观察[11]。

1.2.3ELISA检测肺组织炎症因子表达:大鼠经腹腔麻醉后,眼眶采肺组织1～1.5mL,4℃ 3000 r/ min,离心 10min,收集上清液,分装到 EP 管中,严格按照试剂盒说明采用ELISA检测肺组织清中IL-1、IL-2、IL-6表达水平，于吸光度450nm下进行各样本吸光度检测[12]。

1.2.4Western blot检测巨噬细胞 Wnt-3a和β-catenin蛋白表达水平:液氮研磨各组大鼠肺组织，加入RIPA提取裂解液制成蛋白提取液，使用BCA法测定蛋白浓度，将样品分别加入不同的泳道进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V,5%BSA封闭。分别加入特异性一抗Anti-Wnt-3a antibody (ab101408) (1∶3000,abcam，英国)，Anti-IKB alpha antibody[E130] (ab32518) (1∶ 1/100000，abcam，英国)，Anti-GAPDH antibody(1∶10000，ab8245，abcam，英国)于4℃冰箱过夜。加入特异性的二抗(1∶2000)，孵育1h[13]。采用ECL化学发光液曝光显影，使用Photoshop图像分析软件系统进行半定量分析。

1.2.5透射电镜检测过表达各组大鼠肺组织超微结构:将肺组织准备为小于1mm3组织块，依次通过固定、脱水，包埋，固化，37℃烘箱内过夜，45℃烘箱内12h，60℃烘箱内48h，超薄切片机切片70nm，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜JEOL JEM-1230(80KV)观察。拍片。

2 结 果

2.1Rspondin3干预对急性肺损伤大鼠病理影响:采用HE染色确定过表达Rspondin3对急性肺损伤大鼠肺组织病理状态的影响，见图1,对照组细胞形态完整，不存在肺组织血管增生，而模型组和NC组可见明显的组织结构破坏，细胞结构不完整，有较多的炎性细胞浸润，细胞排列不整齐，组织间隙明显；过表达Rspondin3组可见细胞结构出现破坏，并伴有局部的炎性细胞浸润，细胞排列不整齐，但总体组织损伤程度低于NC组和模型组。

图1 过表达 Rspondin3对大鼠肺部病理损伤学的影响

2.2Rspondin3对急性肺损伤大鼠肺组织清IL-1、IL-2和IL-6表达水平的影响:通过ELISA实验探究过表达Rspondin3对急性肺损伤大鼠肺组织IL-1、IL-2和IL-6表达水平影响，见表1，结果表明与对照组相比，模型组、NC组、Rspondin3组、大鼠肺组织清IL-1、 IL-2和 IL-6表达水平显著升高，与模型组相比和NC组相比，Rspondin3组IL-1、 IL-2和IL-6表达水平显著降低，差异具有显著的统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠肺组织炎症因子表达比较

2.3过表达Rspondin3对急性肺损伤大鼠 Wnt-3a和 β-catenin蛋白表达的影响:通过weshtern blot实验探究过表达Rspondin3对急性肺损伤大鼠肺部组织 Wnt-3a和β-catenin蛋白表达水平的影响，结果表明与对照组相比，模型组、NC组Wnt-3a蛋白β-catenin蛋白表达水平显著降低，与模型组相比和NC组相比，Rspondin3组 Wnt-3a和β-catenin蛋白表达水平显著升高，差异具有显著的统计学意义(P<0.05)。见图2、表2。

表2 Rspondin3对急性肺损伤大鼠 Wnt-3a和 β-catenin蛋白表达的影响

图2 Rspondin3对急性肺损伤大鼠 Wnt-3a和 β-catenin蛋白表达的影响

2.4过表达Rspondin3对急性肺损伤大鼠肺组织超微结构影响:采用透射电镜明确过表达Rspondin3对急性肺损伤大鼠肺组织精细结构的影响，如图3所示,对照组组肺组织结构完整，细胞核胞核形态正常，模型组和NC组组织细胞结构较为紊乱，细胞核出现核固缩，细胞水肿，并伴有空泡化现象。Rspondin3组组织细胞超微结构相对清晰、完整，细胞肿胀程度较轻，细胞器边界相对清晰，结构相对较为完整。

图3 过表达Rspondin3对大鼠急性肺损伤组织超微结构的影响

3 讨 论

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)可由各种疾病和情况引起，包括败血症、肺炎、创伤、急性胰腺炎、吸入胃内容物、接近溺水等造成[8]。当前ALI虽然已经进行了大量的研究，但可行的预测性分子生物标志物和基于分子机制仍然有待揭示[9]。R-Spondins 是血小板反应蛋白的成员1型重复超基因家族[10]，在许多组织中广泛表达，可作为β-连环蛋白信号级联的激活剂发挥作用，导致TCF 依赖的基因激活，并且可以通过与Wnt拮抗剂DKK-1 竞争与Wnt共受体LRP-6和Kremen的结合来调节 Wnt/β-catenin，但其在急性肺损伤中的作用研究较少[11]。因此本研究通过建立大鼠急性肺损伤模型探究Rspondin3过表达后对急性肺损伤后大鼠保护作用的机制，通过HE染色发现Rspondin3组大鼠肺部组织炎性细胞浸润降低，病理损伤降低，尤其是炎性细胞的数量降低，提示炎性组织损伤减少，结合本研究Elisa的结果，过表达Rspondin3后大鼠IL-1、IL-2，IL-6表达水平显著降低，证实此过程伴随着炎症反应的抑制，由此推测Rspondin3可能通过调控白介素家族分子一致炎症反映过程，结合病理结果提示Rspondin3可能通过降低炎症因子释放，本研究推测其可以发挥急性肺损伤过程中的炎症反应，改变肺部组织炎症信号转导状态，降低肺组织由于IL-1、IL-2，IL-6造成的炎性损伤，发挥肺组织实质的保护作用。

Wnt-3a Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络，其功能最常见于胚胎发育和癌症，但也参与成年动物的正常生理过程，研究表明WNT 信号驱动的上皮间质转化促进肺癌转移[12,13]，但是是否参与到急性肺损伤过程尚不清晰，因此本研究通过Western blot证实在急性肺损伤过程肺组织中 Wnt-3a信号通路的激活受到了显著的抑制，β-catenin的表达也显著降低，而过表达Rspondin3表达显著上调，同时结合本文肺组织浆中Elisa对炎症因子IL-1、IL-2和IL-6的抑制作用，提示出Rspondin3可能通过抑制白介素的释放，激活Wnt-3a信号通路的激活，进而发挥抗炎的肺部保护作用。为了准确炎症本研究的推论，因此本研究最后通过透射电镜实验验证了对肺组织的超微结构影响，结果证实过表达Rspondin3肺组织细胞损伤降低，细胞核崩解有显著缓解，证实了Rspondin3可以通过保护细胞结构发挥肺组织的保护作用。

综上本研究表明Rspondin3对大鼠急性肺损伤具有保护作用，其机制可能与 Wnt-3a/β-catenin信号通路的激活有关，本研究可以进一步通过临床试探究患者中Rspondin3表达水平，为临床诊断提供分子理论基础。