促红细胞生成素对低氧诱导的神经干细胞增殖凋亡的影响

罗 聪， 钟 崛

(1.湖北省武汉市第六医院急诊科， 湖北 武汉 430000 2.湖北省武汉市第三医院， 湖北 武汉 430061)

神经干细胞能够在适当的诱导条件下自我更新并分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。当发生脑损伤时，内源性神经干细胞会变得活跃并参与神经修复过程。在严重低氧条件下，神经干细胞的增殖能力降低，凋亡能力增加[1]。此外，神经干细胞比其他类型的细胞对氧浓度更敏感，并且低氧对神经干细胞有显著的不利影响[2]。因此，开发新的药物来促进低氧诱导的神经干细胞增殖、抑制凋亡具有重要意义。已有研究报道，促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)能促进脑内源性神经干细胞的增殖和分化，对宫内感染引起的早产小鼠脑损伤有一定的治疗作用[3]。但关于EPO对低氧诱导的神经干细胞增殖、凋亡的影响鲜有报道。另有研究表明，激活低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)/细胞外信号调节激酶(extracellular-signal-regulated kinase，ERK)通路中的HIF-1α、ERK因子可促进脑损伤后神经干细胞增殖[4]。而EPO能否通过调控HIF-1α/ERK信号通路影响低氧诱导的神经干细胞增殖、凋亡尚不明确。因此，本研究主要探究EPO对低氧诱导的神经干细胞增殖、凋亡的影响以及其作用机制。

1 材料与方法

1.1动物： 24h新生SD大鼠购自广东维通利华实验动物技术有限公司(SCXK(粤)2022-0063)。

1.2主要试剂：EPO购自南京北鱼生物公司；HIF-1α抑制剂YC-1购自爱必信(上海)生物公司；兔源一抗巢蛋白(nestin)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、Bcl-2/腺病毒干扰蛋白3(Bcl-2/adenovirusE1B 19-kDa-interacting protein 3，BNIP3)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteine aspartate proteolytic enzyme-3，Cleaved Caspase-3)、HIF-1α、p-ERK1/2、ERK1/2、GAPDH及羊抗兔IgG二抗均购自英国Abcam公司。

1.3神经干细胞的分离与培养：4%戊巴比妥钠处死大鼠，分离出海马组织，切块，经消化后，离心并收集细胞沉淀，加入1mL神经干细胞完全培养基悬浮细胞沉淀，并接种于50mL培养瓶中。培养6～7d时将已增殖成由数百个细胞形成的大克隆球吹打至打散状态，进行传代培养。观察接种2h、24h、7d时细胞的形态。

1.4免疫荧光鉴定神经干细胞:取第三代神经干细胞克隆球，接种至6孔板中，经固定、通透、封闭后，加入一抗nestin在4℃下孵育过夜，然后与DyLight649红色荧光标记的羊抗兔IgG二抗在室温下孵育2h，封片，观察nestin蛋白表达情况。

1.5细胞分组与处理:取第三代生长良好的神经干细胞悬液，将其分为NC组、Model组、低剂量EPO组(EPO-L组)、高剂量EPO组(EPO-H组)、YC-1组、EPO-H+YC-1组。除NC组外，其它组神经干细胞均需暴露在200μmoL/L 氯化钴中24h以建立低氧损伤细胞模型[5]。低氧诱导24h后，EPO-L组、EPO-H组、YC-1组神经干细胞分别用5 U/m L EPO、25 U/m L EPO、10μmoL/L YC-1处理48h，EPO-H+YC-1组神经干细胞用25 U/m L EPO和10μmoL/L YC-1同时处理48h，NC组、Model组用神经干细胞培养液处理48h后，收集各组细胞用于后续实验。

1.65-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，Brd U)法检测神经干细胞增殖:将各组细胞(5×104个/孔)接种于48孔板中，待细胞贴壁后，加入5μmoL/L Brd U，洗涤、固定后，Brd U和DAPI双染，观察阳性细胞数。

1.7流式细胞术检测神经干细胞凋亡:取100μL细胞悬液(5.0×104个细胞)，将5μL V-FITC和10μL PI加入细胞悬液中，流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.8Western blot检测各组神经干细胞中Cyclin D1、BNIP3、Cleaved Caspase-3、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表达:RIPA裂解缓冲液裂解并提取总蛋白，经定量、电泳、转膜、封闭后，将膜与一抗Cyclin D1、BNIP3、Cleaved Caspase-3、HIF-1α、p-ERK1/2、ERK1/2、GAPDH在4℃下过夜孵育，与二抗在室温下反应2h。Image J软件评估条带灰度值。

2 结 果

2.1神经干细胞的形态学观察:接种2h后可见大量单个圆形细胞生成，细胞大小均匀；24h后大量单个圆形细胞开始聚集，形成许多小的克隆球；7d时克隆球逐渐增殖、变大，每个大克隆球由数百个细胞组成，大克隆球整体轮廓呈现为圆形。见图1。

图1 倒置显微镜观察神经干细胞的形态(Bar=50μm)

2.2神经干细胞的鉴定:第3代神经干细胞克隆球呈现明亮的红色荧光，表明第3代神经干细胞克隆球表达nestin蛋白，见图2。

图2 荧光显微镜观察第3代神经干细胞克隆球中nestin蛋白表达(Bar=50μm)

2.3EPO对各组神经干细胞增殖的影响:与NC组比较，Model组Brd U阳性细胞比例降低(P<0.05)；与Model组比较，EPO-L组、EPO-H组Brd U阳性细胞比例升高，YC-1组Brd U阳性细胞比例降低(P<0.05)；与EPO-L组比较，EPO-H组Brd U阳性细胞比例升高(P<0.05)；与EPO-H组比较，EPO-H+YC-1组Brd U阳性细胞比例降低(P<0.05)，见图3和表1。

图3 Brd U渗入法检测EPO对神经干细胞增殖的影响(Bar=50μm)

表1 EPO对各组神经干细胞增殖的影响

2.4EPO对各组神经干细胞凋亡的影响:与NC组比较，Model组神经干细胞凋亡率升高(P<0.05)；与Model组比较，EPO-L组、EPO-H组神经干细胞凋亡率降低，YC-1组神经干细胞凋亡率升高(P<0.05)；与EPO-L组比较，EPO-H组神经干细胞凋亡率降低(P<0.05)；与EPO-H组比较，EPO-H+YC-1组神经干细胞凋亡率升高(P<0.05)，见图4和表2。

图4 流式细胞术检测EPO对神经干细胞凋亡的影响

表2 EPO对各组神经干细胞凋亡率的影响

2.5EPO对各组神经干细胞中CyclinD1、BNIP3、Cleaved Caspase-3、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表达的影响:与NC组比较，Model组Cyclin D1、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表达降低，BNIP3、Cleaved Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)；与Model组比较，EPO-L组、EPO-H组Cyclin D1、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表达升高，BNIP3、Cleaved Caspase-3蛋白表达降低，YC-1组Cyclin D1、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表达降低，BNIP3、Cleaved Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)；与EPO-L组比较，EPO-H组Cyclin D1、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表达升高，BNIP3、Cleaved Caspase-3蛋白表达降低(P<0.05)；与EPO-H组比较，EPO-H+YC-1组Cyclin D1、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表达降低，BNIP3、Cleaved Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)，见图5和表3。

表3 各组神经干细胞中Cyclin D1 BNIP3 Cleaved Caspase-3 HIF-1α p-ERK1/2蛋白表达比较

图5 western blot检测各组神经干细胞中Cyclin D1、BNIP3、Cleaved Caspase-3、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表达注：A：NC组；B：Model组；C：EPO-L组；D：EPO-H组；E：YC-1组；F：EPO-H+YC-1组

3 讨 论

目前，神经干细胞移植已成为修复脑损伤后神经功能的新方法。然而，中枢神经系统损伤过程中的一些不确定因素可能导致神经干细胞移植的比例降低，进而降低神经干细胞的增殖和分化。Nestin通常被认为是中枢神经系统中神经干细胞标志物[6]。本研究发现第3代神经干细胞克隆球高表达nestin蛋白，证明成功分离出神经干细胞。氯化钴是常用于在体外诱导神经干细胞低氧损伤的药物，本研究利用该药物处理神经干细胞，结果显示，氯化钴诱导的低氧损伤神经干细胞增殖能力减弱，凋亡能力增强。此外，相关研究表明，上调Cyclin D1表达可促进缺氧缺血性脑损伤后海马神经干细胞增殖[7]；BNIP3蛋白是对缺氧最敏感的凋亡蛋白，而Cleaved Caspase-3具有促进细胞凋亡的作用[8]。本研究发现低氧损伤神经干细胞中Cyclin D1蛋白表达降低，BNIP3、Cleaved Caspase-3蛋白表达升高，再次从蛋白质水平上证实了低氧诱导对神经干细胞的增殖起到抑制作用，凋亡能力起到促进作用。

EPO可促进红细胞祖细胞的增殖和分化，还具有神经保护和抗细胞凋亡的作用[9]。据报道，EPO能抑制大鼠创伤性颅脑损伤后神经细胞的凋亡[10]。而关于EPO对低氧诱导的神经干细胞增殖、凋亡的影响尚未见报道，本研究显示，EPO可促进低氧诱导的神经干细胞增殖，抑制细胞凋亡，提示EPO可能成为改善改善低氧损伤神经干细胞的潜在有效药物。

上调HIF-1α表达可促进神经干细胞增殖、抑制细胞凋亡；促进ERK1/2的磷酸化可以促进神经干细胞增殖[11]。本研究结果与其是一致的，本研究显示，与Model组比较，经HIF-1α抑制剂YC-1干预后的低氧损伤神经干细胞中HIF-1α、p-ERK1/2蛋白降低，细胞增殖能力减弱，凋亡能力增强，表明HIF-1α/ERK通路确实参与了低氧诱导的神经干细胞增殖、凋亡过程。此外，本研究还发现EPO可上调低氧诱导的神经干细胞中HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表达升高，且EPO剂量越高，上调作用越明显，推测EPO可能通过激活HIF-1α/ERK通路促进低氧诱导的神经干细胞增殖，抑制细胞凋亡。为了验证该推测，本研究在高剂量EPO处理的基础上再加上YC-1干预Model组神经干细胞，结果显示，YC-1减弱了高剂量EPO对低氧诱导的神经干细胞增殖的促进作用，以及对细胞凋亡的抑制作用。证实了即EPO可能通过激活HIF-1α/ERK通路促进低氧诱导的神经干细胞增殖，抑制细胞凋亡。

综上所述，EPO可能通过激活HIF-1α/ERK通路促进低氧诱导的神经干细胞增殖，抑制细胞凋亡。本研究存在一定的局限性，由于本研究是在体外进行的，因此在体内低氧条件下进一步探索EPO对神经干细胞的影响仍然是必要的。