抗生素治疗慢性子宫内膜炎对子宫内膜基因谱的影响*

何红梅 刘容菊 陈 博 邹志玲 陈雪梅

广东省东莞市松山湖中心医院生殖医学中心 523326

慢性子宫内膜炎(Chronic endometritis, CE)是子宫内膜长期受病原体感染后炎症调节紊乱导致的疾病，在人群中的发病率为10%～11%，但在不孕、复发性流产等患者的发病率偏高，据统计CE在不孕症女性中发生率可高达56.8%[1]；在反复种植失败以及复发性流产女性发生率分别为：7.7%～36.58%、10.8%～36.8%[2-5]。由于CE不仅可以引起患者腹痛、异常子宫出血等不适，还对患者的生殖功能有影响，所以CE的治疗至关重要。目前关于CE治疗的研究较多，但主要集中在临床疗效方面的研究，关于CE治疗对子宫内膜基因表达水平影响的研究较少，目前还没有基于转录组测序的研究。本研究通过对CE患者采用抗生素治疗前后的子宫内膜进行转录组测序，筛选差异基因，并对差异表达基因进行生物信息学分析，以此探讨抗生素治疗CE对子宫内膜基因谱的影响，进一步在基因层面分析抗生素治疗CE的机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取我院生殖医学中心2019年7月—2020年12月期间诊断为CE的不孕不育患者19例作为研究对象。纳入标准：(1)年龄<40岁；(2)病理诊断有CE；(3)月经周期25～35d，自身月经周期变化3d内。排除标准：(1)染色体核型异常；(2)自身免疫性疾病。本研究获得我院医学伦理委员会批准，且所有研究对象均知情同意。

1.2 标本收集 患者月经干净3～7d行宫腔镜下子宫内膜活检或直接使用一次性子宫内膜取样器抽吸子宫内膜，留取2份子宫内膜标本，1份用10%福尔马林溶液固定后送病理检查，1份用DNA/RNA保存液保存于-80℃冰箱。如患者病理诊断CE，保存的标本送至广州研科生物科技有限公司进行转录组测序。诊断CE的患者于月经期开始口服盐酸多西环素片100mg，2次/d及甲硝唑片400mg，2次/d，共服用14d，次月月经干净3～7d使用一次性子宫内膜取样器抽吸子宫内膜，留取2份子宫内膜标本，保存方法同前，如复查病理诊断无CE，则将子宫内膜标本进行转录组测序，如病理诊断仍有CE，则不进行测序，继续给予同前抗炎治疗，直至复查子宫内膜病理诊断无CE，再将无CE的标本进行转录组测序。

1.3 CE诊断 采用苏木精—伊红(HE)染色及CD138免疫组化染色的方法判断是否有CE。每高倍镜视野下见至少1个CD138阳性的浆细胞即诊断为CE。

1.4 转录组RNA建库、测序和分析

1.4.1 建库、测序流程：每份标本总RNA抽提后依次进行质检、mRNA富集、双链cDNA合成、末端修复、加A和接头、片段选择和PCR富集、文库质量检测、Illumina HiSeqTM2500测序。

1.4.2 数据处理：测序得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别分析转化为原始测序序列。原始序列需去除带接头的序列；去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10%的序列；去除低质量序列(质量值SQ≤5的碱基数占整个read长度50%以上的序列)得到待分析序列，后续的分析均基于此序列。

1.4.3 差异表达基因筛选：采用HTSeq软件进行基因表达水平分析，采用DESeq进行差异基因筛选，筛选条件设为: padj < 0.05(padj值是校正后的P值，该值越小表示基因表达差异越显著)且差异倍数|fold change|>2。

1.4.4 差异表达基因的功能富集分析：通过Gene Ontology(GO，http://www. geneontology.org/)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG，http://www.genome.jp/kegg/)数据库对差异表达基因进行功能富集分析，padj<0.05表示显著富集。

2 结果

2.1 基本资料及CE治愈结果 所有研究对象的年龄为26～39岁，平均年龄(31.95±4.40)岁，月经周期25～35d，平均月经周期(29.21±2.35)d，自身月经周期变化0～3d，平均月经周期变化(1.47±1.26)d，体重指数(BMI)16.23～27.89，平均BMI 22.21±3.36。19例患者中有17例经过1个疗程的抗炎治疗后复查CE治愈，1个疗程治愈率为89.47%，另外2例患者经过2个疗程治愈。

2.2 数据质量评估结果 CE治疗前和治疗后样本测序的总长度分别为115.8Gb和116.02Gb。所有样本测序Phred值大于20的碱基比例均>94%，质量值大于30的碱基比例均>87%，GC碱基对的含有量在各样本中基本保持不变(见表1)。以上结果说明，本研究测序质量较好，测序数据符合后续分析要求。

表1 测序数据质量评估结果

2.3 差异表达基因筛选结果 与治疗前相比，CE经过抗生素治疗后子宫内膜有907个基因表达上调，1 248个基因表达下调。用火山图可以推断差异基因的整体分布情况(见图1)。

图1 差异表达基因的火山图

2.4 差异基因功能富集分析 通过GO基因功能富集发现差异基因主要富集于炎症反应调节、急性炎症反应、急性炎症反应调节、细胞—基质黏附、体液免疫反应等生物学过程中，以及细胞外基质部分、细胞外结构部分等细胞成分中(见图2)。KEGG分析显示差异基因主要富集在IL-17 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、细胞黏附分子、细胞因子—细胞因子受体相互作用、细胞外基质—受体相互作用等通路(见图3)。研究结果发现，参与炎症反应调节的差异表达基因中有许多与女性生殖密切相关(见表2)。

表2 参与炎症反应调节的与生殖相关的差异表达基因分类

图2 差异表达基因GO富集分析图

图3 差异表达基因KEGG分析图

3 讨论

CE 是一种可以引起子宫内膜结构和功能破坏的持续性炎症过程，由于局部内膜炎性细胞浸润和炎症介质渗出会改变子宫内膜微环境，从而影响子宫内膜的功能。Di Pietro 等[6]的研究显示CE患者子宫内膜的一些炎性相关基因发生了变化，因而子宫内膜的容受性受到了影响，从而对女性的生殖功能产生巨大的影响，所以CE的治疗至关重要。关于CE治疗的研究颇多，但是既往的研究主要是从临床结局方面分析CE治疗对患者的影响，而本研究旨在通过转录组测序在基因水平方面分析CE的治疗对子宫内膜功能的影响。本研究结果显示，与治疗前相比，CE治疗后有907个基因上调，1 248个基因下调；GO和KEGG富集分析显示这些基因主要富集在炎症反应和免疫反应相关的功能和信号通路，这说明CE治疗主要是通过改变参加炎症反应的一些相关基因来改善子宫内膜的功能。

CCN4是参与炎症反应、胚胎发育、细胞凋亡等多种生物学过程。Tang Q等[7]的研究发现高水平的CCN4降低子宫内膜孕激素受体的水平。由于孕激素受体在子宫内膜蜕膜化、胚胎种植及妊娠维持有重要的作用[8]，孕激素受体表达下调对子宫内膜的容受性有影响[9]，所以CCN4的高表达可以影响子宫内膜的容受性。本研究结果显示CE治疗后CCN4表达下调，有利于子宫内膜的功能恢复。

子宫内膜中的趋化因子通过募集与妊娠有关的免疫细胞，调节子宫内膜种植窗的免疫微环境，从而对子宫内膜容受性产生影响。本研究结果显示，与治疗前相比，CE治疗后部分趋化因子有显著的差异表达，其中CCL5、CCL24、CXCL17表达下调，而CX3CL1表达上调。CCL5可以趋化巨噬细胞的迁移和活化，而巨噬细胞可以分泌妊娠毒性物质，所以CCL5表达下调可以减少子宫内膜分泌妊娠毒性物质，利于妊娠[10]。CCL24和CX3CL1在生殖方面也起着重要的作用。研究发现CCL24和CX3CL1可以促进滋养细胞的增殖、迁移，从而促进胚胎的种植，但CCL24呈剂量依赖型抑制滋养细胞的侵袭，浓度越高对滋养细胞的抑制作用越强[10-11]。CXCL17是抑炎因子，目前还没有CXCL17与子宫内膜功能相关的研究，本研究发现CE治疗后CXCL17表达下调，推测CXCL17的低表达可能更有利于维持子宫内膜的正常功能，这需要进一步的研究证实。

白介素(Interleukin，IL)不仅参与机体的炎症、免疫反应，还可以影响胚胎的种植。Wang H等[12]的研究发现IL-1b可以提高子宫内膜容受性。子宫内膜中IL-15表达上调可以促进子宫自然杀伤细胞增殖并且增加其毒性，从而影响胚胎着床[13-14]。本研究结果显示CE治疗后IL-1b表达上调，IL-15表达下调，这提示CE治疗有助于子宫内膜功能的恢复。Ju J等[15]发现CE患者子宫内膜的IL-1b表达高于正常人群，而本研究结果显示CE治疗后相比治疗前IL-1b表达上调，与之不符，这可能是由于对比人群不同及研究方法不同造成的结果不一致。

补体(Complement，C)不仅仅参与病原体的清除，还在维持子宫内膜正常的生殖功能方面发挥重要的作用。在妊娠过程补体活化剂和抑制剂调节补体，使母胎界面的补体维持动态平衡，从而维持正常的妊娠，补体过度激活可以通过炎症损伤机制、促凝机制和细胞免疫机制导致复发性流产[16]。本研究发现，CE治疗后C3、C4A、C6、C7、C9的表达主要呈下调状态，这表明CE治疗可以通过降低补体的表达保护子宫内膜免受炎症的损伤，调节子宫内膜的免疫平衡，维持子宫内膜正常的生殖功能。

免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)是参与体液免疫应答反应的免疫活性物质，有抗炎和免疫调节作用。CE患者高度水肿的基质中高表达多种免疫球蛋白，这些免疫球蛋白可能对胚胎植入产生不良影响[17]。本研究结果显示CE治疗后多种免疫球蛋白基因表达下调，这可能是因为经过抗生素治疗后子宫内膜的炎症反应消失，参与炎症免疫反应的免疫球蛋白的表达随之下调，进而恢复子宫内膜的功能。

本研究通过转录组测序探讨了抗生素治疗CE对子宫内膜基因谱的影响，其结果为进一步研究CE影响女性生育功能的机制和通路奠定了基础。